[发明专利]一种检测肿瘤细胞EGFR基因突变的方法及芯片

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测肿瘤细胞EGFR基因突变的方法及芯片。

背景技术

表皮细胞生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR），属于受体酪氨酸激酶超家族成员，通过PI3K活化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT，激活凋亡抑制蛋白Caspase9，抑制凋亡促进细胞增殖。

EGFR活性增高或持续性活化，将促使细胞过度增殖和肿瘤发生，并与肿瘤侵润转移、新生血管生成、抗凋亡等肿瘤细胞学行为密切相关。研究发现在40-80%的肺癌、14-91%的乳腺癌、33-74%的胃癌、40-80%的前列腺癌及36-100%的头颈部肿瘤中EGFR表达增高，且其表达水平与恶性程度呈负相关，表达水平越高预后越差，因而EGFR成为重要的肿瘤治疗靶分子。

针对EGFR的吉非替尼（商品名为易瑞沙）、厄洛替尼（商品名为特易凯）等小分子化学药物以及西妥昔单抗和帕尼单抗等大分子药物均已应用于临床。吉非替尼和厄洛替尼竞争性结合细胞内酪氨酸激酶结构域中的ATP结合位点，阻止受体自身磷酸化和下游信号分子活化，诱导肿瘤细胞凋亡。2004年Lynoh和Paeg最先发现EGFR基因突变与吉非替尼等药物敏感性相关，吉非替尼治疗NSCLC（非小细胞肺癌）总有效率为10-30%，EGFR基因突变肿瘤的有效率为75-95%，无基因突变肿瘤的有效率小于10%。EGFR基因突变肿瘤的单用吉非替尼疗效优于铂类和紫杉醇化疗，而野生型肿瘤则疗效不及铂类或紫杉醇化疗。此后，在不同人群中进行的临床实验均证实了EGFR基因突变在酪氨酸激酶抑制剂类药物敏感性/耐药性预测和指导用药上的价值。与酪氨酸激酶抑制剂类药物敏感性和耐药性相关的突变主要集中在EGFR基因的第18、19、20、21外显子区域。

吉非替尼和厄洛替尼等靶向药物价格昂贵，用药前分析肿瘤EGFR基因突变状态，有助于筛选对吉非替尼、厄洛替尼等酪氨酸激酶抑制剂类（TKIs）药物敏感的肿瘤患者，提高治疗的有效率，也避免浪费医疗资源。

针对EGFR基因突变检测，目前主要有DNA测序、TaqMan探针等检测方法。DNA测序技术操作复杂，设备及试剂昂贵。TaqMan探针等方法需多次扩增和检测，存在操作繁琐、费时费力、费用较高等局限性。因此迫切需要简便、快速和廉价的检测产品，以满足临床检测需求。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测肿瘤细胞EGFR基因突变的方法及芯片，使得所述方法和芯片能够准确、简便、快速的检测与酪氨酸激酶抑制剂类抗癌药物如吉非替尼、厄洛替尼的敏感性和耐药性相关的EGFR基因突变。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种检测肿瘤细胞EGFR基因突变的方法，包括以下步骤：

步骤1、以SEQ ID NO:1-8所示序列为引物、肿瘤细胞DNA为模板进行PCR扩增，获得扩增产物，其中SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示序列的5＇端均修饰有生物素；

步骤2、SEQ ID NO:9-24所示序列的探针分别与步骤1所得扩增产物杂交，然后洗涤除去未结合的扩增产物，最后与偶联金纳米微粒的链亲和素孵育，根据金纳米微粒颜色变化判断突变结果。

其中，所述杂交的DNA用量至少为10ng，所述探针的工作浓度优选为10-400nmol/L，更优选为100nmol/L。

临床研究结果显示，与吉非替尼、厄洛替尼等抗癌药物敏感性相关的EGFR基因的突变集中在第18-21外显子区域，其中，49%左右为第19外显子746-752密码子区域的插入/缺失突变，45%左右为第21外显子2573位点突变，5-10%为第18外显子2155位点突变和第21外显子2582位点突变。这些位置的突变能够影响酪氨酸激酶结构域的ATP结合口袋的空间结构，增加与吉非替尼、厄洛替尼等酪氨酸激酶抑制剂类抗癌药物的结合力，从而增加药物的敏感性。

而与吉非替尼、厄洛替尼等抗癌药物耐药性相关的EGFR基因的突变主要为第19外显子2281位点突变和第20外显子2369位点突变。这些位置的突变均影响吉非替尼、厄洛替尼等酪氨酸激酶抑制剂类抗癌药物与酪氨酸的结合力，增加药物的耐药性。