[发明专利]一种气相色谱-质谱联用检测脂肪酸含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于气相色谱-质谱联用技术（GC-MS法）快速检测动物样品中脂肪酸含量的方法。

背景技术

脂肪酸是构成人体脂肪和类脂的基本物质，是细胞膜磷脂的重要成分，直接调节细胞膜的组成及蛋白质与膜内受体。脂肪酸根据饱和度的不同可分为饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸(MUFA)、多不饱和脂肪酸(PUFA)。

短链SFA可调节肠道运动，促进结肠细胞增殖，也可增加肠道黏膜损伤处的循环血流，促进肠道黏膜结构和功能的恢复；另外，短链饱和脂肪酸可治疗转流性结肠炎、远段溃疡性结肠炎和放射性结肠炎。此外，SFA摄入过多增加高胰岛素(Ins)血症的风险以及患乳腺癌的危险。

MUFA可降低血浆总胆固醇和LDL的水平，降低血小板的聚集率，减少机体内自由基脂质超氧化物的作用，也具有降低血压的作用。MUFA改善了内皮白细胞黏附因子的基因表达，从而可预防动脉粥样硬化，降低患冠心病的危险性。MUFA还能起到降血糖的作用，另外，因为MUFA是神经元细胞膜组成成分，它能维持神经元细胞膜完整性，因此MUFA可防止记忆下降。

PUFA是脑的成长、细胞间相互作用，第二信息向乙酰胆碱的应答及神经传导功能等脑功能发育不可缺少的物质，可用于治疗精神分裂症。另外，不饱和脂肪酸有利于膜的流动性，更有利于胰岛素(Ins)的透膜吸取及与受体的结合。

在正常情况下人体内脂肪酸是一稳定的化学组分，处于相对平衡，生物体内脂肪酸的改变能诱导神经生理、认知和其他行为的变化，尤其是必需脂肪酸含量的改变。而某些脂肪酸(如亚油酸，亚麻酸等高级脂肪酸)对人体保健极为重要，但人体又不能自行合成，根据测定含量的高低，可通过饮食营养加以调节，提高人们的健康和防止疾病的发生。

血浆中游离脂肪酸的测定是先将脂肪酸与Cu²⁺作用，以氯仿萃取后用铜试剂测定Cu²⁺的浓度，进而得到游离脂肪酸的含量，该方法不仅繁琐，而且只能测定脂肪酸总量。气相色谱法虽然具有高分离能力，但对脂肪酸定性鉴定时要有标准物质对照，无标样时测定较困难。另外，脂肪酸组分复杂，难以分离，传统方法通常采用酸水解、碱水解以及皂化法等，步骤繁琐，所需样品量大，不适用于科研、临床中微量样品的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、快速、实时的气相色谱-质谱联用检测脂肪酸含量的方法，特别适合对动物组织中微量样品的检测。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

1）样品准备：将10mg动物组织剪碎后得样品，将样品置于螺口玻璃瓶中；

2）提取、皂化及甲酯化：将质量分数为37%的浓盐酸与2,2-二甲氧基丙烷按照0.02︰0.98的体积比混合得浓盐酸2,2-二甲氧基丙烷溶液，向螺口玻璃瓶内的样品中分别加入20μL质量浓度为1mg/mL的内标物石油醚溶液，以及1mL浓盐酸2,2-二甲氧基丙烷溶液，然后充氮气保护下震荡20min，震荡后用氮气将螺口玻璃瓶内的液体吹干，吹干后向螺口玻璃瓶内加入2.5mL质量分数为13%的三氟化硼甲醇溶液，然后将螺口玻璃瓶于80-85℃水浴中加热1小时；

3）加热结束后向螺口玻璃瓶内加入2.5mL去离子水，然后用石油醚萃取2次，取石油醚层，将石油醚层用无水Na₂SO₄干燥，干燥后过滤得滤液，将滤液减压浓缩至体积不再减少得检测样，向检测样充入氮气进行保护；

4）采用气相色谱-质谱联用仪对检测样内的脂肪酸进行测定；

5）数据分析及样品鉴定：经过步骤4）后，根据获得的原始光谱数据及质谱数据，计算检测样内各脂肪酸组分的相对含量以及绝对含量。

所述动物组织包括大脑、肝脏、肾脏、心脏、血液或肌肉组织。

所述动物组织的来源包括小鼠、大鼠、比格犬、恒河猴、猪、牛、鸡、鸭、鱼或人。

所述气相色谱的工作条件为：检测样溶于500μL正己烷后上样，进样量为1μL，进样方式为不分流，载气为流速1.5mL/min的氦气，升温程序为：初始温度为60℃，保持4min，然后以5℃/min升至150℃，然后以4℃/min升至300℃，保持5min。

所述质谱的工作条件为：采用EI源、正离子检测，电子能量为70eV，离子源温度为230℃，单四级杆温度为150℃，扫描方式为全扫描方式，电子倍增器电压为1070V，溶剂延迟为3.75min。

所述相对含量采用面积归一化方法进行计算。