[发明专利]一种从南极磷虾中提取生物素的方法及高效薄层扫描分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从南极磷虾中提取生物素的方法及高效薄层扫描分析方法。

背景技术

南极磷虾（学名Euphausia superba），又名大磷虾或南极大磷虾，是一种生活在南极洲 水域的磷虾。南极磷虾是似虾的无脊椎动物，并以群集方式生活，有时密度达到每立方米 10,000—30,000只。它们以微小的浮游植物作为食物，它们长成约6厘米长，2克重，有6 年的寿命。它们是南极生态系统的关键物种，若以生物质能来说，它们可能是地球上最成功 的动物物种（大约共有5-50亿吨，因估量方法不同有较大差异）。因南极磷虾蕴藏量巨大， 加上群体的生活容易捕捞，所以吸引很多国家对它进行开发。目前，南极磷虾用于虾油生产 和作为鱼的饲料。

过去有人检测生物体中生物素含量的方法有微生物法、高效液相色谱法、气相色谱法、 ELISA法和荧光法等等，其中微生物法和高效液相色谱法是最常用的方法。微生物方法操作 麻烦和耗时（检测一个样品需2～3天的时间），而高效液相方法投资大、溶剂用量大、成本 较高。高效薄层色谱法是南极磷虾中生物素提取，快速，准确，可靠的检测方法。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种从南极磷虾中提取生物素的方法及检测生物素的 高效薄层扫描分析方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种从南极磷虾中提取生物素的方法，步骤如下：

（1）取1公斤冷冻的南极磷虾，在40～60℃烘干，然后加入3～9升的氯仿，在常温下 搅拌提取1～3次，每次时间为30～60分钟，过滤得处理虾粉；

（2）将上述得到的处理虾粉按虾粉（W）：二甲基甲酰胺（V）=1g：25～40ml的比例加 入二甲基甲酰胺，在75～95℃水浴上搅拌提取1～2小时，得提取液；

（3）上述得到的提取液在10,000rpm下离心10分钟，取上清液，向上清液中加入等体 积量的乙醇，50～65℃下旋转蒸发浓缩，得浓缩液，即为含有生物素的样品液，干燥后即得 含有生物素的粉末状物质。

一种检测生物素的高效薄层扫描分析方法，步骤如下：

（1）取待检测样品液（即上述方法制备得到的浓缩液）4μl，点在涂有硅胶GF₂₅₄高效薄 层板（10cm×10cm）上，以体积比二氯甲烷：异丙醇：甲醇：冰乙酸=1～3：1～3：2～3：0.01～ 0.15作为展开剂，在展开缸（10cm×12cm×15cm）内展开，展距为6cm，并采用外标一点法 点1μl（0.19,0.3,0.66,1.28,3.31mg/ml）生物素标准品溶液，同时展开，展开的时间 为40分钟，展开的距离为6cm，然后晾干；

（2）将2,4-二甲氨基肉桂醛、浓硫酸和无水乙醇混合，配成染色液，其中2,4-二甲 氨基肉桂醛终浓度为0.1～0.2%（质量体积分数，单位g/ml），硫酸终浓度为10～20%（质量 体积分数，单位g/ml）；展完后晾干的展板，用染色液喷雾染色，将板放进通风橱5分钟后， 喷上10%的石蜡氯仿溶液（质量体积分数，单位g/ml），这样可以增加检测灵敏度，可得到与 背景对比明显的标准品的斑点和样品的斑点，其R_f=0.50；冷却后放入Camag薄层扫描仪-Ⅲ 扫描，扫描波长为530nm，通过检测样品和标准品对紫外线的吸光度计算得到生物素的含量。

计算生物素含量时，还需要做以下辅助工作：绘制标准曲线：

取Sigma公司销售的生物素标准品溶解于二甲基甲酰胺，其浓度分别为0.19,0.3,0.66, 1.28,3.31mg/ml，在高效薄层板上各点1μl，用Camag薄层扫描仪3，以530nm的吸收波长 扫描，经扫描仪的软件Wincats 1.4.1统计，得到的线性方程y=5801.1051+13.5261x。相关 系数r=0.99984，RSD=1.67%。

本发明的检测生物素的高效薄层扫描分析方法，其精确度、板内变异、板间变异、加样 回收率等情况如下：

1.精确度的测定

制备1.28mg/ml生物素标准溶液，在同一块高效薄层板上点四个点，每点为1μl，分别 在0，2，4和6小时扫描测量，证明了4小时后才稳定，如表1所示。

2.板内变异和板间变异