[发明专利]转AaWRKY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法

权利要求书

1.一种转AaWRKY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，采用基因克隆方法获得青蒿WRKY类转录因子AaWRKY1基因；

步骤二，把所述AaWRKY1基因连结于表达调控序列，构建含AaWRKY1基因的植物表达载体；

步骤三，将所述含AaWRKY1基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含所述AaWRKY1基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

步骤四，利用所述构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的整合外源目的基因AaWRKY1基因的转基因青蒿植株；

步骤五，对所述转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。

2.根据权利要求1所述的转AaWRKY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，在所述步骤四中，所述转化包括以下步骤：外植体的预培养；农杆菌与外植体的共培养；抗性再生植株的筛选。

3.根据权利要求2所述的转AaWRKY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述预培养包括以下步骤：青蒿种子用体积分数为75%乙醇浸泡1min，再用质量分数为20%NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3～4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基中，25℃光照培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。

4.根据权利要求2所述的转AaWRKY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述共培养包括以下步骤：将所述叶片外植体转到共培养培养基中，滴加含活化的所述含AaWRKY1基因植物表达载体的根癌农杆菌的1/2MS悬液，使所述外植体与所述悬液充分接触，28℃暗培养3天，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。

5.根据权利要求2所述的转AaWRKY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述筛选包括以下步骤：将所述共培养3天的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基上于25℃光照培养，每两周继代培养一次，经过2～3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽，将所述生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基上培养至生根，即可获得Kan抗性再生青蒿植株。

6.根据权利要求1所述的转AaWRKY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，在所述步骤四中，所述PCR检测包括以下步骤：设计合成AaWRKY1基因的引物；进行DNA扩增；紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株。

7.根据权利要求1所述的转AaWRKY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步骤五中，所述HPLC-ELSD测定包括以下条件：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为甲醇:水，甲醇:水的体积比为70:30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量为20μL，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数为7，载气压力5bar。