[发明专利]转AaWRKY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用转基因技术提高青蒿中青蒿素含量的方法，特别是一种转AaWRKY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能。可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。

目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，不同种植环境和种植品种中其平均含量在青蒿叶片干重的0.01～1%，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具有可行性。有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1%，在芽中最高也只有干重的0.16%，而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性也不高。

经对现有技术文献检索发现，Ma等2009年在《Plant & Cell Physiology》(植物和细胞生理学)发表了题为“Isolation and Characterization of AaWRKY1,an Artemisia annua Transcription Factor that Regulates the Amorpha-4,11-diene Synthase Gene,a Key Gene of Artemisinin Biosynthesis”（“调控青蒿素生物合成关键酶ADS的WRKY类转录因子AaWRKY1的分离和克隆”)的论文，报道通过酵母单杂和凝胶阻滞实验初步的验证了AaWRKY1能够和ADS的启动子结合，并通过构建过量表达载体瞬时转青蒿，发现青蒿中青蒿素合成途径中的酶的表达都增加了。这说明AaWRKY1在青蒿素的合成中具有重要的作用。

现有技术中青蒿WRKY类转录因子AaWRKY1能够调控青蒿素合成途径中的第一个关键酶ADS，是青蒿素代谢工程的重要元件。采用基因工程手段，用AaWRKY1基因转化青蒿，将打破青蒿素生物合成的限速瓶颈，获得青蒿素高产的青蒿植株，为规模化生产青蒿素提供一条新途径。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种转AaWRKY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明建立了稳定提高青蒿中青蒿素含量的方法，为青蒿素的规模化生产提供了高产、稳定的新药源。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种转AaWRKY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括如下步骤：

步骤一，采用基因克隆方法获得青蒿WRKY类转录因子AaWRKY1基因；

步骤二，把所述AaWRKY1基因连结于表达调控序列，构建含AaWRKY1基因的植物表达载体；

步骤三，将所述含AaWRKY1基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含所述AaWRKY1基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

步骤四，利用所述构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的整合外源目的基因AaWRKY1基因的转基因青蒿植株；

步骤五，对所述转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。

优选的，在所述步骤四中，所述转化包括以下步骤：外植体的预培养；农杆菌与外植体的共培养；抗性再生植株的筛选。

优选的，所述预培养包括以下步骤：青蒿种子用75%乙醇浸泡1min，再用20%NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3～4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基中，25℃光照培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。

优选的，所述共培养包括以下步骤：将所述叶片外植体转到共培养培养基中，滴加含活化的所述含AaWRKY1基因植物表达载体的根癌农杆菌的1/2MS悬液，使所述外植体与所述悬液充分接触，28℃暗培养3天，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。