[发明专利]检测T-2毒素的酶联免疫试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测T-2毒素的酶联免疫试剂盒，其适用于饲料（原料、配合料、浓缩料）中T-2毒素测定。

技术背景

T-2毒素（T-2 toxin）是镰刀菌所产生的单端孢霉烯族毒素中毒性最强的一种，能导致动物产生中毒反应的次级代谢物质，它广泛分布于自然界，常在被污染的田间作物和库存谷物中发现。无论饲料中T-2毒素的含量是高水平还是低水平均会导致动物采食量下降、增重缓慢、免疫系统损伤等。研究表明，T-2毒素对人和动物表现出基因毒性、免疫毒性、血液毒性等多种毒性，并可致多种细胞凋亡。1973年联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)在日内瓦召开的联席会议上，把T-2毒素同黄曲霉毒素一样作为自然存在的最危险的食品污染源。

T-2毒素的测定方法主要有薄层色谱法（TCL）、气相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、放射性免疫检测法、酶联免疫法等，TLC法是最早最常用的检测方法之一，具有操作简单、费用低廉、分离效果好、分离速度快等优点，是一种常见的检测方法，但是还存在样品提纯繁琐、定量不够精确、成本较高等缺点，而且同时TLC法涉及到一个可视化颜色定量的问题，还是不如气相色谱和液相色谱方便、准确。气相色谱和液相色谱分析方法需要对T-2毒素进行衍生化处理；液相色谱-质谱联用灵敏度较高，不需要进行衍生化处理，因而液相色谱-质谱联用是检测T-2毒素比较理想的方法。目前报道比较多的方法为单极质谱选择离子技术(SIM)。然而，对于复杂基质样品（如谷物），采用多级串联质谱技术可以更为有效地去除基质的干扰，保证痕量物质分析的准确性。TCL法、色谱法等有的太复杂，有的缺乏灵敏度，有的价格昂贵，不适于常规毒素分析。免疫学检测因其灵敏、快速、简单，而被用于T-2毒素的测定。应用于T-2毒素测定的免疫学方法主要有放射免疫法、酶联免疫吸附法及免疫荧光法等。由于放射性同位素储存、使用不便，近年来非放射性标记应用较多。酶联免疫吸附法(ELISA)以其灵敏度高、特异性好、操作简便、成本低等优点已被我国于1992年定为检测标准，ELISA法作为一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大量样品的快速筛选。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于T-2毒素含量测定的酶联免疫试剂盒，其操作简单，适合现场大批量样品的筛选。

本发明试剂盒，它包括：

（1）包被有T-2毒素偶联抗原的酶标板；

（2）T-2毒素标准品溶液；

（3）浓缩酶结合物；

（4）酶结合物稀释液；

（5）底物显色液；

（6）终止液。

所述T-2毒素偶联抗原为T-2毒素半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白可为卵清蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白。

所述T-2毒素半抗原的结构如下：

所述T-2毒素半抗原制备过程：24mg T-2毒素、30mg邻苯二甲酸酐和0.1ml吡啶在2ml DMSO中的混合液，在80℃下搅拌反应15小时，蒸除溶剂，柱层析纯化得到邻苯二甲酸单T-2毒素酯。

所述浓缩酶结合物为酶标记的T-2毒素单克隆抗体，所述标记酶为辣根过氧化物酶；酶结合物是采用过碘酸钠法将标记酶与抗体进行偶联得到的。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括T-2毒素标准品溶液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液。

所述的终止液为1~2mol/L的硫酸或盐酸溶液，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，底物液A液为过氧化脲溶液，底物液B液为四甲基联苯胺溶液。

所述的酶结合物稀释液为pH7.2~7.4，含0.05%~0.1%牛血清白蛋白，0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

其中酶标板在制备过程中所用的包被缓冲液为pH9.0~9.6，0.2mol/L碳酸盐缓冲液，所用封闭液为pH7.2~7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成0.1~0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h或4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150~200μl封闭液，37℃温育1~2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明的检测原理为：