[发明专利]一株具有百草枯抗性的硝化还原假单胞杆菌

说明书

技术领域

本发明涉及一株对百草枯（Paraquat，PQ）具有抗性的硝化还原假单胞杆菌（Pseudomonas nitroreducens）菌株，属于生物技术领域，具体为一株能在含强氧化剂PQ（50mmol/L）或者硝普钠（Sodium nitroprusside,SNP，200μmol/L）的培养基上生长的革兰氏阴性短杆菌菌株。 

该菌株中分离得到一个基因PnPQR，该基因转化到大肠杆菌中，获得对大肠杆菌具有抗性的菌株，通过农杆菌介导法转化烟草，能提高烟草对百草枯的抗性。 

背景技术

除草剂百草枯（paraquat,PQ）是世界范围内应用最为广泛的除草剂之一，目前在100多个国家的100多种作物中除草（http://www.paraquat.com/chinese），其应用面积仅次于草甘膦。草甘膦在全球市场近乎垄断的地位，从某种程度上讲，也得益于转基因抗草甘膦作物的培育成功。单一除草剂压力势必引发杂草的抗性问题。培育新型抗除草剂作物既是新的知识产权和市场竞争的需求，也是保护优异除草剂的迫切需要。国际市场上百草枯仅次于草甘膦，但是尚未见抗百草枯作物出现。 

为了获得丰富百草枯抗性资源，我们从百草枯污染的土壤中筛选抗性微生物，继而从中分离抗性基因。本发明从抗性土壤中分离了1个百草枯抗性菌株(S3)并对其进行了一些列的生理生化鉴定和16S rDNA序列分析，对其进行了系统分类。 

本发明还从S3中分别克隆了1个基因PnPQR，该基因ORF全长均为1233bp，编码410个氨基酸残基，含有11个跨膜区（TMS），属于非典型的主要易化超家族（Major facilitator superfamily,MFS）。该基因在大肠杆菌BL21菌株中异源表达，能提高大肠杆菌对百草枯的抗性。过量表达的PnPQR转基因烟草植株T0代叶片分析初步表明，该基因能赋予烟草百草枯抗性。 

发明内容

本发明的目的是获得一株具有百草枯（Paraquat，PQ）抗性的菌株并了解该菌株的特征特性。本发明的菌株是一种利用稀释平板法从PQ污染的土壤悬浮液中分离得到的具有高抗百草枯（PQ）的硝化还原假单胞菌（Pseudomonas nitroreducens）菌株，是能够在含强氧化剂PQ(50mmol/L)或者硝普钠(Sodium nitroprusside,SNP，200μmol/L)的培养基上生长的革兰氏阴性，短杆菌，具有硝化还原特性和反硝化还原特性，接触酶阳性、吲哚实验阴性。 

一株对百草枯（Paraquat，PQ）具有抗性的硝化还原假单胞杆菌菌株，该菌株是利用稀释平板法从PQ污染的土壤悬浮液中分离得到的，该菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 6300。 

本发明还公开了一种植物表达载体pCAMBIA2301-PnPQR，是通过下述步骤制备： 

（1）从硝化还原假单胞杆菌（Pseudomonas nitroreducens）CGMCC 6300中分离百草枯抗性基因PnPQR： 

以P1：5'-CCACTCCGATGTCCAATC-3'和P2：5'-TTACCCGCTCGTCCCTAT-3'为引物，通过PCR从硝化还原假单胞杆菌（Pseudomonas nitroreducens）CGMCC 6300中分离序列如SEQ ID NO.1所示的目标基因PnPQR，将PnPQR连接到pMD18-T载体中，构成pMD-PnPQR载体； 

（2）pCAMBIA2301载体启动子和终止子的添加 

以pBI121为模板，应用引物35SF：5'-AATTCGATTAGCCTTTTCAATTTCAG-3'和35SR：5'-GAGCTCAGGAAGTTCATTTCATTTGGAG-3'，扩增CaM 35S启动子片段；用EcoRⅠ和SacI对PCR产物和pCAMBIA2301同时进行双酶切，用T4 ligase连接成pCAMBIA2301-35S；再以pBI121为模板，用引物NOSF：5'-GCATGCATCGTTCAAACATTTGGCAATAA-3'和NOSR：5'-GANTCGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3'，扩增NOS终止子片段，再用SphⅠ和HindIII对PCR产物和pCAMBIA2301-35S-NOS同时进行双酶切，用T4 ligase连接成pCAMBIA2301-35S-NOS。 

（3）pCAMBIA2301-PnPQR植物表达载体的构建