[发明专利]人工条件下黑尾叶蝉获得水稻矮缩病毒的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明所属的领域为生物技术领域，尤其是涉及一种人工条件下黑尾叶蝉获得水稻矮缩病毒的方法及其应用。

背景技术

水稻矮缩病毒（Rice drawf virus，RDV）是一种常见的水稻病毒病之一，属于呼肠孤病毒科（Reoviridae），植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)。该病毒病最早于1939年在四川省西昌发现，六十年代后期在我国开始流行，现今主要流行于日本、朝鲜、东南亚以及我国东南部等水稻产区。目前该病毒病在我国的一些水稻产区对水稻生产造成危害。水稻矮缩病毒病除危害水稻外，还危害大麦、小麦等禾本科植物。水稻从苗期至分蘖期易感此病，在这期间感病后，整体症状表现为植株矮缩、分蘖增多、叶片浓绿、僵直。生长后期感病水稻不能抽穗结实，病叶症状则表现分为白点型和扭曲型两种。白点型症状表现为植株矮缩、分蘖增多、叶色浓绿；叶片或叶鞘上出现与叶脉平行的虚线状黄白色点条斑，以基部最明显；病株根系发育不良；孕穗后期发病，只在剑叶、叶鞘上出现清晰的点条病斑；抽穗后发病，仅在剑叶鞘上表现病斑。扭曲型症状表现为病株生长缓慢、显著矮缩、分蘖增多、叶片浓绿，在光照不足情况下，心叶抽出呈扭曲状，随心叶伸展，叶片边缘出现波状缺刻，色泽淡黄；孕穗期发病，多在剑叶叶片和叶鞘上出现白色点条，穗颈缩短，形成包颈或半包颈穗。近几年该病毒病在在福建、浙江、广西、贵州、河南等稻区发生，而在云南寻甸县、嵩明县的水稻产区发病较普遍，中部的昆明、东北部区的曲靖和昭通、南部和西南部的景洪和德宏的部分水稻产区也都有发生。

在自然条件下水稻矮缩病毒通过黑尾叶蝉(Nephotetix cincticeps)和电光叶蝉（Recilia dorsalia）传播，能在昆虫体内复制，一旦获毒，即终身带毒，并可通过虫卵传给下一代，若虫及成虫均能传毒，且高效传毒。黑尾叶蝉在病稻上吸汁最短获毒时间5分钟，获毒后需经一段循回期才能传毒，循回期20℃时为17天，29.2℃时为12.4天。叶蝉获毒15-20天后，体内病毒浓度迅速增加，之后以持久性方式传毒给寄主植物，并且存在明显的间歇传毒特性。病毒可在黑尾叶蝉体内越冬，黑尾叶蝉在看麦娘上以若虫形态越冬，翌春羽化迁回稻田为害，早稻收割后，迁至晚稻上为害，晚稻收获后，迁至看麦娘、冬稻等38种禾本科植物上越冬，带毒虫量是影响该病发生的主要因子。所以对于黑尾叶蝉及水稻矮缩病毒的早期监测和预警十分必要。以单抗为核心建立的血清学方法是最经济、最有效的检测黑尾叶蝉体内及水稻中RDV的高通量的检测方法，因而筛选合适的抗体尤为重要；此外筛选抗病品种是防治水稻病毒病最经济、最有效的方法。通过利用水稻病叶饲喂黑尾叶蝉，获得携带RDV的黑尾叶蝉，可用于抗RDV单抗的筛选，用以单抗为核心建立的血清学方法对该病毒病的发生流行情况进行预报、预警；并可接种水稻品系，有助于快速鉴定抗水稻矮缩病毒病的水稻品种，为抗水稻矮缩病毒病的水稻资源的发掘、抗性品种选育；携带RDV的黑尾叶蝉的获得能为RDV与寄主及其媒介昆虫之间的互作研究提供物质基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种人工条件下黑尾叶蝉获得水稻矮缩病毒的方法及其应用。

人工饲喂条件下黑尾叶蝉获得水稻矮缩病毒的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）黑尾叶蝉的获得：

从非水稻矮缩病发生地区的水稻田间采集捕获黑尾叶蝉后在室内用无毒稻苗饲养，待黑尾叶蝉成虫交配后单头虫单独产卵，随机抽取群体中10%的黑尾叶蝉用RT-PCR方法检测带毒情况，保留不带毒雌虫的后代并建立室内种群；

2）黑尾叶蝉的获毒：

黑尾叶蝉从冷冻保存的感染RDV水稻或活的感病水稻病株中获毒：

饲毒前，黑尾叶蝉在滤纸保湿的烧杯中饥饿1～3小时；从-10℃至-80℃保存冰箱中取出冷冻保存的病株，移入烧杯内，每个烧杯放1～10株病株；接入20～300头3～4龄无毒的黑尾叶蝉若虫，烧杯用尼龙纱布封口；把烧杯放入温室或植物生长箱内饲养，温度为26～30℃，相对湿度为60 %～75 %，光周期为16L：8D；饲毒1～2天后将存活的黑尾叶蝉移入生长于温室或植物生长箱的健康水稻苗上喂养，温度为26～30℃，相对湿度为60 %～75 %，光周期为16L：8D，直至渡过病毒的循回期，约15～20天；饲毒后的单头黑尾叶蝉在健康水稻上单独产卵，随机抽取其后代群体中10%的黑尾叶蝉用RT-PCR方法检测带毒情况，保留带毒雌虫的后代并建立室内带毒种群，即获得携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉；

或者，黑尾叶蝉从种植于温室或植物生长箱内的水稻病株上获毒：