[发明专利]一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺

权利要求书

1.一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：步骤如下：

（1）粗提纯：

①取胰脏粉或胰脏，加10～30倍量纯化水溶解提取，搅拌均匀后加入氯化钙至浓度为5～8%，调整pH为6.0～8.0，冷冻静置沉淀，离心收集沉淀；

②将上述沉淀加入到事先配制好的2～4%的草酸盐溶液中，充分搅拌25～35分钟溶解，静置沉淀进行粗提纯，虹吸上清液得粗品液；

（2）溶液配制：配制浓度为20～40%的无机盐平衡液，调整pH为4.0；配制浓度为20～40%的无机盐洗脱液，调整pH为6.0；

（3）亲和柱层析：

①平衡：将装有HS-Sepharose亲和层析填料的层析柱，用上述配制的pH4.0、浓度20～40%的无机盐平衡液平衡，直至进出层析柱的溶液pH值与电导值相同时平衡完毕；

②进样：调整上述制备的含胰激肽原酶的粗品液的pH值与无机盐平衡液一致，粗品液电导值等于平衡液电导值，根据每升填料最大亲和量3000万单位进行上样；

③洗涤：用上述配制的pH4.0、浓度20～40%的无机盐平衡液冲洗一个柱体积；

④洗脱：用上述配制的pH6.0、浓度20～40%的无机盐洗脱液冲洗柱子，同时用754分光光度计跟踪检测流出液在254nm处的吸收值，收集洗脱液，得收集液；

（4）超滤脱盐：将上述收集液加注射用水超滤脱盐浓缩，当溶液电导值小于1000μs/cm时，停止加注射用水，继续浓缩，得浓缩液；

（5）除菌：上述浓缩液用微孔滤膜进行除菌过滤，得无菌滤液；

（6）冻干：加入辅料进行冻干，即得胰激肽原酶。

2.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：所述步骤（1）①中，pH调整采用氨水调节，冷冻静置沉淀温度为零下20℃以下，离心转速为大于3000转/分。

3.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：所述步骤（1）②中，2～4%的草酸盐溶液的组成为：每100ml草酸盐溶液中含1～2g的草酸铵，1～2g的草酸钾。

4.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：所述步骤（2）中，无机盐选自硫酸钠、硫酸铵、硫酸钾，硫酸镁、氯化钠或氯化铵中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：所述步骤（3）中，所用层析柱直径为体积为50L；以洗脱液效价大于30单位/cm时为洗脱收集起点，以洗脱液效价小于20单位/cm时为洗脱收集终点。

6.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：所述步骤（4）中，超滤脱盐的截留分子量为1万道尔顿，当浓缩至液体体积为1/3～1/5时，关闭超滤机，用注射用水冲洗，至超滤机回管中效价低于30单位/ml时，得浓缩液。

7.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：所述步骤（5）中，微孔滤膜为0.22μm的微孔滤膜。

8.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：所述步骤（6）中，加入辅料进行冻干的具体步骤如下：辅料用注射用水加热溶解后过0.22μm微孔滤膜，冷却后加入到无菌滤液中，控制无菌滤液的效价在70单位/mg以上，混合均匀后放入冻干箱中冻干。

9.根据权利要求8所述的一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：所述冻干的工艺条件如下：将产品在零下20～50℃温度下预冻3～5小时，将导热油以10℃/小时的速度升至35℃，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升华，当制品温度达到30℃时，保温3小时直至完全干燥。

10.根据权利要求8所述的一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：所述辅料选自乳糖、甘露醇、明胶或右旋糖苷中的一种或多种。