[发明专利]一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺。

背景技术

胰激肽原酶是一种具有扩张血管改善微循环作用的周围血管扩张药，胰激肽原酶在体内作用于激肽原释放出激肽，直接作用于小血管和毛细血管，从而产生一系列的药理效应，如舒张毛细血管、扩张小动脉等，在扩张血管的同时改善血管的通透性和血液流量；有调节血压作用，降低心肌耗氧量；还可促进前列腺的分泌，改善各器官血流。胰激肽原酶作为一种国际公认的微循环改善剂，是一种疗效确切、不良反应轻微的酶类药物，适宜于长期服用，适用于各种微血管循环障碍疾病的治疗。胰激肽原酶对早期肾病的治疗效果显著，能有效地改善肾脏的微循环，与其它药物配合治疗，能降低肾小球入球动脉压，具有促使肾小球基底膜早期损伤修复等作用，该产品的市场前景十分广阔。

胰激肽原酶是从哺乳动物的胰脏中经提取纯化而得到的，即从胰脏本身、胰酶粉以及胰激肽原酶粗品（中间体）中提取，并通过纯化而制得。现有胰激肽原酶的纯化方法包括使用多糖非树脂物料进行纯化，例如使粗的胰激肽原酶吸附到一种弱碱性阴离子交换纤维素上并分离（见日本专利发行No.11697/62）；或者将一种铝盐或者锌盐加入含有胰激肽原酶的水溶液中，将产生的胰激肽原酶的沉淀吸附到弱碱性的阴离子交换纤维素上或交联葡聚糖（Sephadex）上，并分离之（见日本公开专利发行No.56886/73）；另一种已知的纯化方法是使用离子交换树脂，即加入一种蛋白质沉淀剂到胰脏提取液中，产生的胰激肽原酶吸附到大孔强碱性阴离子交换树脂，并分离之（见日本公开专利No.103715/73）。然而，利用上述多糖型非树脂物料进行吸附的方法缺点是离子交换物料的物理强度不够，不能进行大规模制备。而离子交换树脂法不能使产品在洗脱时除去不需要的杂质。因此，上述方法得到产品的纯度还有待于进一步提高。

公开号为CN101073666的中国发明专利公开了一种制备高纯度胰激肽原酶原料药的方法，其采用QAE-Sepharose Fast Flow离子柱层析纯化制得胰激肽原酶的原料药，其纯度高达75%以上，效价增加55单位/mg以上，比活达到350单位/mg蛋白以上。但其存在以下缺陷：比活达不到600单位/mg蛋白，纯度达不到90%，不能做为注射剂的原料药进行应用。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，该制备工艺包括产品粗提纯、溶液配制、亲和柱层析、超滤脱盐、无菌过滤、冻干、包装等工序，产品经过HS-Sepharose亲和柱层析分离纯化后，成品的纯度高达95%以上，效价增加70单位/mg以上，比活达到600单位/mg蛋白以上。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，步骤如下：

（1）粗提纯：

①取胰脏粉或胰脏，加10～30倍量（重量倍数）纯化水溶解提取，搅拌均匀后加入氯化钙至浓度为5～8%（g/ml），调整pH为6.0～8.0，冷冻静置沉淀，离心收集沉淀；

②将上述沉淀加入到事先配制好的2～4%（g/ml）的草酸盐溶液（沉淀g与草酸盐溶液ml的比例为1g：4～8ml）中，充分搅拌25～35分钟溶解，静置沉淀进行粗提纯，虹吸上清液得粗品液。

上述步骤①中，pH调整采用氨水调节，冷冻静置沉淀温度为零下20℃以下，离心转速为大于3000转/分。

上述步骤②中，2～4%（g/ml）的草酸盐溶液的组成为：每100ml草酸盐溶液中含1～2g的草酸铵，1～2g的草酸钾。

（2）溶液配制：配制浓度为20～40%（g/ml）的无机盐平衡液，调整pH为4.0；配制浓度为20～40%（g/ml）的无机盐洗脱液，调整pH为6.0，检测溶液的电导值。

所述无机盐选自硫酸钠、硫酸铵、硫酸钾，硫酸镁、氯化钠或氯化铵中的一种或多种。

（3）亲和柱层析：

①平衡：将装有HS-Sepharose亲和层析填料的层析柱，用上述配制的pH4.0、浓度20～40%（g/ml）的无机盐平衡液平衡，直至进出层析柱的溶液pH值与电导值相同时平衡完毕；

②进样：调整上述制备的含胰激肽原酶的粗品液的pH值与无机盐平衡液一致，粗品液电导值等于平衡液电导值（以无机盐或水调整电导值），根据每升填料最大亲和量3000万单位进行上样；

③洗涤：用上述配制的pH4.0、浓度20～40%（g/ml）的无机盐平衡液冲洗一个柱体积；