[发明专利]检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及遗传学和分子生物学领域，具体地说，涉及一种检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒。

背景技术

凝血是血液由液体状态转变为不流动的凝胶状态的过程，是生物体天然的自我保护机制，能阻止血液从破损的血管中流失。除血小板外，所有参与凝血过程的物质统称为凝血因子，目前已知的凝血因子有20余种，包括传统的因子I-XIII，以及PK、HMWK等。当血管内皮细胞受到创伤，组织因子等蛋白与血液接触，凝血会立即启动。首先血小板流向创伤点堆积形成栓塞，称为初级止血反应；同时，血浆中的各种凝血因子发生级联反应形成纤维蛋白，在血小板栓塞上形成紧密的纤维蛋白网，该过程称为次级止血反应。血液凝固是一系列凝血因子连锁反应的结果，其特点是当凝血过程被激活时，其中一个凝血因子以其上游凝血因子为底物，使之激活为具有活性的酶，而该酶又催化激活下一个因子。凝血异常将增加失血或血栓形成的风险。

牛凝血因子XI缺失（Factor XI deficiency）最早（1969年）发现于美国荷斯坦牛中（Kociba等,1969），此后，1975年在加拿大也发现一头患病的荷斯坦公牛（Gentry等,1975）。该遗传缺陷病的临床表现为血凝时间延长，血浆中XI因子活性降低。杂合个体除因注射、去角、阉割等损伤而发生出血症外（严重的需要输血），出血可能性相对较小，而隐性纯合子出血情况较为严重，其新生犊牛大多死亡。其分子致病机理是牛27号染色体上的凝血因子XI（Factor XI）基因第12外显子上一个76bp的插入造成（Marron等,2004）。

2005年日本科学家报道了日本黑牛中一种新的凝血因子XI突变。在Factor XI基因的第9外显子上有15bp的插入，造成凝血活性降低（Kunieda等,2005）。同时，报道了一种检测该变异的方法。其基本原理是，在该突变两侧设计引物，通过聚合酶链式反应扩增目的片段，进而通过琼脂糖凝胶电泳方法进行基因型判定。然而，在实际应用中，由于琼脂糖凝胶分辨率低，而该目的片段的野生型与突变型的条带只相差15bp，因此不易区分，导致出现假阴性的结果。此外，该检测方法所需高浓度琼脂糖凝胶的制作过程也较为繁琐，且电泳时间长。

发明内容

本发明的目的是克服现有检测方法中易出现假阴性结果的缺陷，提供一种能够准确高效地检测牛凝血因子XI基因外显子9内15个核苷酸插入突变的试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的PCR引物组合，其为：

引物对1：

a）上游引物wild-F5’-CTGCTGTGCAGTGTTCTGCC-3’；

b）下游引物wild-R5’-GGAGCGTCTATGGGACTTGA-3’；和

引物对2：

a′）上游引物mutant-F5’-TGCAAGCCCTTTCTTCTGAT-3’；

b′）下游引物mutant-R5’-AATGGCATATATTCTGCACA-3’。

引物对1的上游引物跨越了插入片段区域，但不包含插入片段，因此仅能与野生型等位基因序列特异结合，特异性地扩增野生型等位基因；而突变型等位基因没有扩增产物。

引物对2的下游引物包含插入片段的序列，因此仅能与突变型等位基因序列特异结合，特异性地扩增突变型等位基因；而野生型等位基因没有扩增产物。

本发明还提供含有上述引物组合的检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒。

前述试剂盒中还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

更优选地，前述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明进一步提供上述PCR引物组合或试剂盒在检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变中的应用，包括步骤：1）提取待测牛的基因组DNA；2）以步骤1）中提取的DNA为模板，分别采用引物对1和引物对2，进行PCR扩增反应；3）分析PCR产物。

其中，步骤3）具体为：