[发明专利]核酸探针及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及核酸探针及其制备方法和应用，更具体地，本发明涉及制备探针的方法、核酸探针、核酸探针在制备测序文库中的用途、制备宏基因组测序文库的方法、宏基因组测序文库以及确定宏基因组序列信息的方法。

背景技术

目前，宏基因组学已经成为基因组学中的一个新兴的重要科学研究领域，是研究直接从环境样本例如人类胃肠道、土壤等中直接提取基因组遗传物质，并进行相关分析的学科。宏基因组学研究的快速发展，使得大规模的宏基因组学研究相继展开，大量新的微生物种群和新的基因将得以发现，对人类健康将有积极的现实意义，为后续研究肠道微生物与人的肥胖、肠炎、糖尿病等疾病的关系提供非常重要的理论依据，达到预防和监控的目的。

然而，宏基因组所研究的样本在提取过程中很难避免宿主基因组的污染，例如人肠道环境的宿主基因组污染约2%-3%，而在口腔、生殖道、皮肤、呼吸道等部位获取的样本DNA中宿主基因组污染的比例均达到80%甚至90%以上。样本中大量宿主外源污染的存在使得有效数据的测序成本相对大大增加。第二代高通量测序使得从全基因组角度研究环境样本中各个组分成为可能，但是对于宿主样本高污染的样本DNA则需要耗费极大的测序通量才能够达到预期的测序效果。

因而，目前的宏基因组研究方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能有效对宏基因组测序文库进行筛选的手段。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种制备探针的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：将DNA样本进行片段化，以便获得第一DNA片段；将所述第一DNA片段进行平端化，以便获得经过平端化的第一DNA片段；将所述经过平端化的第一DNA片段与接头进行连接，以便获得连接接头的第一DNA片段；利用PCR引物组对所述连接接头的第一DNA片段进行扩增，以便得到第一扩增产物，所述PCR引物组包括第一PCR引物和第二PCR引物，所述第一PCR引物和第二PCR引物的5’末端碱基均被生物素标记，所述第一扩增产物构成双链DNA探针。由此，通过该方法最终得到的产物可以有效地作为双链DNA探针，进一步可以将这些所得到的双链DNA探针应用于宏基因组（与双链DNA探针属于相同宿主来源）的测序文库的构建，可以有效地去除其他来源DNA对测序文库的污染，例如，可以有效地应用于宏基因组测序文库的构建，有效地去除宿主DNA对宏基因组测序文库的污染，有效地提高宏基因组测序的准确性。

在本发明的第二方面，本发明提出了核酸探针。根据本发明的实施例，所述核酸探针可以根据前面所述的方法获得。这些核酸探针可以有效地作为双链或单链DNA探针，进一步可以将这些所得到的双链或者单链DNA探针应用于这些DNA样本（与DNA探针属于相同宿主来源）的测序文库的构建，可以有效地去除其他来源DNA对测序文库的污染，例如，可以有效地应用于宏基因组测序文库的构建，有效地去除宿主DNA对宏基因组测序文库的污染，有效地提高宏基因组测序的准确性。另外，前面针对探针制备方法中所描述的其他特征和优点，同样适于该核酸探针，为方便，不再赘述。

在本发明的第三方面，本发明还提出了前面所述核酸探针在制备测序文库中的用途。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备宏基因组测序文库的方法。根据本发明的实施例，该制备宏基因组测序文库的方法包括：根据前面所述的方法，利用宿主基因组DNA制备探针；将用于构建测序文库的宏基因组DNA进行片段化，以便获得第二DNA片段；将所述第二DNA片段进行平端化，以便获得经过平端化的第二DNA片段；在所述经过平端化的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得3’末端添加碱基A的第二DNA片段；将所述3’末端添加碱基A的第二DNA片段与接头进行连接，以便获得连接接头的第二DNA片段；以及将所述连接接头的第二DNA片段进行扩增，以便获得第二扩增产物，所述第二扩增产物构成所述宏基因组测序文库，其中，利用所述探针对文库构建中间产物进行筛选以便获得经过纯化的文库构建中间产物，所述文库构建中间产物为所述第二DNA片段、经过平端化的第二DNA片段和连接接头的第二DNA片段的至少之一。由此，可以有效地构建宏基因组测序文库，根据本发明的实施例，根据本发明实施例的方法制备的DNA探针可以有效地对文库构建中间产物进行筛选，由此，可以除去最终所得到测序文库中来自宿主DNA的污染，对测序文库进行纯化，有效地提高宏基因组测序的准确性。