[发明专利]基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒及其应用

权利要求书

1.基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒，其特征在于，该元件盒为基于酵母DNA损伤响应的RNR3-yEGFP-CYC1基因片段。

2.实现权利要求1所述的基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒的构建方法，其特征在于，该构建方法包含下列步骤：

（1）从野生面包酵母中提取基因组DNA

1a、取野生面包酵母，接种于YPD培养液中，在30℃，200转/分钟的条件下，振荡培养16小时，得到野生面包酵母菌液；

其中：YPD培养液的配方重量百分比为：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，余者为水；

1ｂ、取野生面包酵母菌液1.5毫升，用4000转/分钟离心2分钟，取沉淀物悬于200微升提取缓冲液中； 

其中：提取缓冲液的配方为： 曲拉通X-100 2%,十二烷基磺酸钠1%, 氯化钠0.1摩尔,乙二胺四乙酸1毫摩尔, 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10毫摩尔, 余者为水，pH 8.0；

1c、加入0.3克酸洗玻璃珠、100微升酚、100微升氯仿，震荡3分钟后，以12000转/分钟离心10分钟，取上层液体；

1d、加入所取液体体积2倍的无水乙醇，在-20℃静置30分钟，以12000转/分钟离心15分钟，去上清，取沉淀物；

1e、将沉淀物溶解于20微升无菌水，即为野生酵母基因组DNA；

（2）扩增RNR3启动子基因片段

用野生酵母基因组DNA作为扩增模板，通过上游引物RNR3 Pro-1: 5’AA CTG CAG CAA GCA CAT AAA AAA TCA G 3’和下游引物RNR3 Pro-2: 5’TTA GAC ATT TGT GTG GGA GTA TTT GAT T 3’，利用PCR技术，扩增得到RNR3启动子基因片段；

（3）扩增yEGFP编码区基因片段以及终止子CYC1基因片段

质粒PUG36作为扩增模板，通过上游引物yEGFP-1: 5’CCA CAC AAA TGT CTA AAG GTG AAG AAT T 3’和下游引物yEGFP-2: 5’TAC ATG ACT TTG TAC AAT TCA TCC ATA C 3’，利用PCR技术，扩增得到yEGFP编码区基因片段；

质粒PUG36作为扩增模板，通过上游引物CYC1-1: 5’TGT ACA AAG TCA TGT AAT TAG TTA TGT C 3’和下游引物CYC1-2: 5’TCCG GAA TTC GGT ACC GGC CGC AAA TTA AAG 3’，利用PCR技术，扩增得到终止子CYC1基因片段；

 （4）扩增基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYC1基因片段

用RNR3启动子基因片段、yEGFP编码区基因片段及终止子CYC1基因片段按照摩尔比1:1:1的比例为扩增模板，通过上游引物RNR3 Pro-1: 5’AA CTG CAG CAA GCA CAT AAA AAA TCA G 3’和下游引物CYC1-2: 5’TCCG GAA TTC GGT ACC GGC CGC AAA TTA AAG 3’，利用PCR技术，扩增得到基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYC1基因片段；

上述PCR 的条件为：94℃ 5分钟；94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 1分钟，30个循环；72℃ 5分钟。

3.用权利要求1所述的基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒构建基于酵母DNA损伤响应的生物感应器，其特征在于，该构建方法包含下列步骤：

3a、敲除五基因缺失的对氧化损伤高敏感性的面包酵母中MAG1和RAD1基因，获得复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株，步骤如下：

3a1、将质粒??mag1:: hisG -URA3-hisG用限制性内切酶EcoRⅠ和BgalⅡ进行酶切，得到敲除组件mag1??::hisG -URA3-hisG；

3a2、将敲除组件用醋酸锂转化方法转入五基因缺失的对氧化损伤高敏感性的面包酵母中，发生同源重组，通过SD-Ura选择性平板筛选得到六基因缺失的面包酵母突变株；

3a3、 将质粒??rad1::Blast用限制性内切酶SalI进行酶切，得到敲除组件rad1??::hisG -URA3-hisG，将敲除组件用醋酸锂转化方法转入六基因缺失的面包酵母突变株中，发生同源重组，通过SD-Ura选择性平板筛选得到复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株，该突变株即为缺失yap1Δcwp1Δcwp2Δsnq2Δpdr5Δrad1Δmag1Δ七个基因的面包酵母；

3b、将权利要求2步骤（4）中的基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYC1基因片段克隆到pBluescipt载体上,利用PstI内切酶和EcoR1内切酶酶切进行连接，得到克隆pBluescipt-RNR3-yEGFP-CYC1；

3c、将克隆pBluescipt-RNR3-yEGFP-CYC1用BamH1内切酶和EcoR1内切酶进行酶切，得到两端酶切位点为BamH1和EcoR1的基因片段，再克隆到pM4366载体中,用Not1内切酶切下片段HO-hisG-URA3-hisG-RNR3-yEGFP-CYC1-HO；

3d、将 HO-hisG-URA3-hisG-RNR3-yEGFP-CYC1-HO 片段用醋酸锂转化方法转入复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株中，通过SD-Ura选择性平板筛选得到基于酵母DNA损伤响应的生物传感器yap1Δcwp1Δcwp2Δsnq2Δpdr5Δrad1Δmag1Δ-RNR3-yEGFP-CYC1酵母株。