[发明专利]基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，尤其涉及经过遗传基因改造的微生物对环境化学污染物的监测。

背景技术

面包酵母是一种简单真核生物，单细胞，遗传改造操作简单，培养简便快速且环境友好，适合作为一种模式生物应用于生命科学研究中。目前在环境污染检测技术领域中，面包酵母作为一种简单真核生物越来越被受到重视，一些以面包酵母为模式生物的检测系统得到了发展。

遗传毒性致癌物是指能与DNA反应，引起DNA损伤而致癌的化学致癌物，可用生物化学试验或间接地应用遗传毒性试验方法来鉴定遗传毒性致癌物，包括直接致癌物和间接致癌物。

遗传毒性致癌物的检测对于环境监测及保护有重大的现实意义。构建一个检测DNA损伤的生物传感器系统，除宿主细胞外，需具备以下两个基本元件：感应元件和连接于此后的效应元件。前者利用其自身功能可对DNA损伤进行响应，并开启后者的表达，从而产生可检测出的信号。将这两个元件组合在一起的基因片段称为生物传感器元件盒。

核糖核苷酸还原酶（Ribonucleotide reductase, RNR）是催化核糖核酸转变为脱氧核糖核苷酸为DNA 合成和修复提供所需dNTPs 的限速酶。核糖核苷酸还原酶 (RNR)在DNA 的复制和修复中具有重要的作用，维持着细胞的脱氧核糖核酸库存，并因此在细胞周期过程中被严格控制以确保DNA 复制的高保真。酵母细胞中所存在的RNR包含有四种亚单位（RNR1、RNR2、RNR3、RNR4），其中RNR3编码核糖核苷酸还原酶大亚基，非酶活力所必需，在细胞正常生长条件下几乎无表达，一旦机体DNA发生损伤或合成受到抑制时，可诱导其及时大量表达。研究表明酵母RNR3可为DNA损伤的紧急修复提高大量dNTPs，RNR3 转录后mRNA受DNA损伤诱导表达量可增加100多倍。这一特点使RNR3可作为制备生物传感器的感应元件。

绿色荧光蛋白（GFP）是从水母中分离出的天然生物发光蛋白，其性质稳定，无需添加任何底物及辅助因子，即在紫外或蓝光的激发下发出绿色荧光。它在细菌、真菌、植物和动物细胞中表达时都能发出荧光, 具有活体、原位、实时表达的特点。而酵母增强型绿色荧光蛋白（yEGFP）是一种密码子优化后的增强型绿色荧光蛋白，它可在酵母细胞中增强表达。对比此前广泛使用的编码B-gal半乳糖苷酶的报告基因lacZ，GFP具有直接用于活体细胞检测，并可克服利用酶作为报告基因的一系列缺点（破坏酵母细胞壁，影响酶活显色的因素复杂等），使检测手段多样、自动化等一系列优点。利用绿色荧光蛋白作为制备生物感应器的效应元件，使得环境中遗传毒性致癌物测评体系更有利地向高通量，快速，便捷的阶段发展。

利用SOE法（Gene Splicing by Overlap Extension）进行PCR基因片段拼接，即通过PCR过程中基因片段的交错延伸实现拼接。该方法是利用PCR 技术在体外进行有效的基因重组, 而且不需要内切酶消化和连接酶处理, 该技术使用简易。由于引物只需要与模板有效结合, 尤其是5’端序列不必与模板完全配对, 因此扩增引物的5’端可以添加两种酶切位点以便于后期克隆。

流式细胞技术是分析细胞中的一个重要领域, 该技术为细胞学研究手段之一, 能够对细胞和细胞器及生物大分子进行高达每秒上万个细胞个体的分析, 而且一个细胞多参数分析并可分选细胞。这种以流动的方式(相对静态方式) 测量细胞与传统的用荧光镜检测细胞比较, 具有速度快,精度高, 准确性好的特点。

发明内容

 本发明的目的是，提供一种基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒及其构建方法，其核心内容是构建生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYC1，并将该生物传感器元件盒转入复合DNA损伤超高敏感型面包酵母七基因缺失突变株基因组中进行应用，可检测多种遗传毒性致癌物，大大提高该生物传感器对检测环境中遗传毒性化学物质的敏感性，扩大其检测应用范围，增强其检测的应用潜力。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

（一）、一种基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒 RNR3-yEGFP-CYC1的构建方法为：

（1）提取野生型面包酵母基因组DNA，通过特异性引物，以面包酵母基因组DNA为模板，PCR扩增得到RNR3启动子基因片段；

（2）提取质粒PUG36，通过特异性引物，以该质粒为模板，PCR扩增得到yEGFP编码区基因片段；