[发明专利]一种快速检测猪巨细胞病毒的LAMP试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域中的疾病诊断技术，具体涉及一种快速检测猪巨细胞病毒的LAMP试剂盒。

背景技术

猪巨细胞病毒(Porcine cytomegalovirus，PCMV)是一种有囊膜的双链DNA病毒，隶属疱疹病毒科，β疱疹病毒亚科，巨细胞病毒属。1955年英国首次报道了本病毒的感染，1972年日本也报道了此病毒，并于1985年首次分离到病毒。目前该病毒广泛分布于世界各地，英国和日本猪群中血清抗体检测率分别达90％和98.4％.北美和澳大利亚也有报道，其中美国的发病率最高，抗体保有率为90％.我国河北、河南以及广西等地也先后报道了该病的发生。该病毒在体外增殖相对困难，据报道，仅猪肺泡巨噬细胞适宜病毒的首次分离，猪输暖管细胞和人成纤维细胞支持病毒的复制。猪巨细胞病毒的具体结构尚不清楚，仅见DNA聚合酶、gB、MCP等几个基因的研究。基于这些基因的研究，研究人员发现其同源性与人疱疹病毒6型和7型更相近，认为应将本病毒划入玫瑰疹病毒属更为恰当。另外，在异种器官移植方面，猪器官逐渐作为人类器官移植的主体，由此在进行移植时很有可能就将猪体内的潜在危险转移到人身上，猪巨细胞病毒有可能就是其中一个。

猪巨细胞病毒感染主要发生幼龄仔猪，在易感猪群中引起胚胎和仔猪死亡，表现为发育不良、鼻炎和肺炎等临床症状。成年猪多成隐形感染。猪巨细胞病毒感染的临床症状并不明显，并且无疫苗预防以及有效的治疗方法和商业化的检测试剂盒问世，因此研发检测PCMV病毒的LAMP试剂盒，对此病毒进行快速的检测，对PCMV的流行病学调查、临床诊治和疾病预防均有巨大意义。

环介导的等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由日本学者T.Notomi于2000年发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖四条特异性的引物针对目的序列的四个区域进行扩增，所运用的DNA聚合酶具有链置换功能，因此可以实现恒温扩增。由于其扩增依赖于目的序列的四个特异性区域，因此其特异性和敏感性均较普通PCR和荧光定量PCR高，而且由于该反应在恒温条件下进行，因此不需要昂贵的仪器，而使用普通的水浴锅即能进行扩增反应，另外在扩增反应可以在一个小时之内完成，所需时间短，且其反应产物易于观察，可以通过肉眼判定扩增样本是否为阳性。基于以上优点，LAMP至发明之日其，已被广泛用于病原的检测，如病毒性出血败血症、巨细胞病毒、埃博拉病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒、结核杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、禽流感、猪流感等病毒性疾病和细菌性疾病的检测。到目前为止，未发现运用LAMP方法检测PCMV病毒的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足提供一种用于检测PCMV的LAMP试剂盒，根据PCMV的基因序列设计四对特异性的引物对PCMV核酸进行恒温扩增，此扩增不需要昂贵的设备，可在一个小时内完成，具有高效的敏感性和特异性，并且仅需要通过观察反应管是否有沉淀产生即可判断扩增结果。

本发明采用如下技术方案：

一种快速检测猪巨细胞病毒的LAMP试剂盒，每个反应用量为23μL的LAMP反应液和1μL的BstDNA聚合酶，该23μL的LAMP反应液中各组分及浓度如下：2.5μL的聚合酶缓冲液，3mM的MgSO₄，1M甜菜碱，0.4mMdNTP，0.25mM引物F3，0.25mM引物B3，2mM引物FIP，2mM引物BIP；其中，所述2.5μL的聚合酶缓冲液的组分及浓度为：20mMTris-HCl、其pH 8.8，10mMKCl，10mM(NH₄)₂SO₄，，1％Triton X-100；

其中各引物序列为：

F3：AAAAATATAGTTCCGCACACT；

B3：TTTCTAATCTCGGCAGCG；

FIP：TGACATGAACGTCTCTATACGTCGTTTTTTTTTTGTTAGGACGTATACCA；

BIP：TGATAGGTCTTCATATAAAGTGCCCTTTTGACCATTCAAATTTATATATCCAGC。

本发明所述用于检测PCMV的LAMP试剂盒使用方法，其步骤为：

(1)运用无菌双蒸水配制上述23μL的LAMP反应液于反应管中；