[发明专利]一种重组人表皮生长因子工程菌的构建和筛选方法

权利要求书

1.一种重组人表皮生长因子(hEGF)工程菌的构建和筛选方法，其特征在于重组hEGF工程菌的构建和筛选方法按以下步骤进行：一、通过PCR技术获得卡那霉素抗性基因，通过化学合成方式获得大肠杆菌cspA基因功能元件；二、对编码SUMO蛋白的基因和编码hEGF的基因序列，按照大肠杆菌的密码子偏好性，进行密码子优化，然后进行化学合成获得适合在大肠杆菌中大量表达的序列OPT-SUMO-hEGF；三、将第一步和第二步所得的片段连入pET21质粒中，得到pET-Kan-cspA-SE质粒；四、以pET-Kan-cspA-SE质粒为模板，构建转座体；五、将转座体转入大肠杆菌Origami 2(DE3)；六、筛选出融合蛋白SUMO-hEGF表达量高的菌株。

2.根据权利要求1所述的重组hEGF工程菌的构建和筛选方法，其特征在于在适合的PCR反应条件下，获得卡那霉素抗性基因。

3.根据权利要求2所述的利用PCR方法获得卡那霉素抗性基因所用的初始质粒为pET42a。

4.根据权利要求2所述的利用PCR方法获得卡那霉素抗性基因所用的引物序列如下：

引物Kan-1：5′-ggcaaattagatctcttttctacggggtctgacg-3′(SEQID NO：1)

引物Kan-2：5′-aatttgcccatatgcgatttcggcctattggtta-3′(SEQID NO：2)。

5.根据权利要求1所述的重组hEGF工程菌的构建和筛选方法， 其特征在于cspA基因功能元件的序列为：

ggcaaattca tatgaaggaa tggtgtggcc gattaatcat aaatatgaaa

aataattgtt gcatcacccg ccaatgcgtg gcttaatgca catcaaattg

tgagcggata acaatttgat gtgctagcgc atatccagtg tagtaaggca

agtcccttca agagttatcg ttgatacccc tcgtagtgca cattccttta

acgcttcaaa atctgtaaag cacgccatat cgccgaaagg cacacttaat

tattaagagg taatacacca tgaatcacaa agtgggatcc aagctttagg

taatctctgc ttaaaagcac agaatctaag atccctgcca tttggcgggg

atttttttat ttgttttcag gaaataaata atcgatcgcg taataaaatc

tattattatt tttgtgaaga ataaatttgg gtgcaatgag aatgcgcagg

ccctttcgtc tcgcgcctcg aggcagtct。

6.根据权利要求1所述的重组hEGF工程菌的构建和筛选方法，其特征在于选用pET21为初始质粒来构建pET-Kan-cspA-SE质粒。

7.根据权利要求6所述的选用pET21为初始质粒构建pET-Kan-cspA-SE质粒，该结构构建需要以下步骤：通过双酶切和连接，把卡那霉素抗性基因片段插入pET21质粒构建pET-Kan质粒；通过双酶切和连接，把cspA基因片段插入pET-Kan质粒构建pET-Kan-cspA质粒；通过两步酶切和连接，把OPT-SUMO-hEGF序列插入pET-Kan-cspA质粒构建pET-Kan-cspA-SE质粒。