[发明专利]一种重组人表皮生长因子工程菌的构建和筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种高效胞内可溶表达重组人表皮生长因子(以下简称为h EGF)工程菌的构建和筛选方法。

背景技术

人表皮生长因子(Human epidermal growth factor，hEGF)是含有53个氨基酸残基的单链多肽，分子量为6216道尔顿；hEGF序列包含6个半胱氨酸残基，可以形成三对分子内二硫键，这些二硫键稳定了hEGF的构象，对其发挥生物学功能起到了重要作用。

在体内，hEGF诱导上皮发展，促进血管生成，抑制胃酸分泌。在体外，hEGF是成纤维细胞，上皮细胞和内皮细胞的促细胞分裂剂，可以促进表皮细胞的集落形成。目前，hEGF在医疗和化妆品行业具有广泛的应用。

hEGF广泛存在于人的体液中，早期主要从尿液中提取(Starkey，R.H.et al.，Science，189，800-802，1975)，由于hEGF在体液中的含量很小，直接提取成本很高，目前主要通过基因工程菌表达纯化，常用的方法包括分泌表达和胞内表达。hEGF的分泌表达，虽然表达量较高，但是hEGF的同质性和完整性受到影响，使得下游的纯化步骤复杂化。而在胞内表达时，现有做法是把hEGF基因以质粒的形式引入大肠杆菌胞内，但在发酵条件下，菌株的质粒丢失现象较为明显，严重影响了hEGF的得率(Wong，DK-H et al.，J.Ind.Microbiol.Biot.，21，31-36，1998)。如果能把hEGF基因直接引入大肠杆菌的基因组，那么它的丢失几率会大大降低，但在此之前没有这方面的报道。

此外，在胞内表达hEGF时，由于大肠杆菌的胞内为还原性环境，不利于hEGF分子内三对二硫键的形成，所得的hEGF均以包涵体的形式存在，为了获得有活性的hEGF，需要经历一个复杂的变复性过程，影响hEGF的产率。

有研究表明，利用Origami(DE3)宿主菌和SUMO标签表达融合蛋白可解决原蛋白可溶率低的问题(Su，Z.et al.，Protein Pept.Lett.，13，785-792，2006)。在此之前没有把SUMO标签应用到hEGF表达上的报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有重组表皮生长因子胞内表达可溶率低和发酵培养中的质粒丢失问题，提供一种高效、稳定、高可溶性表达hEGF工程菌的构建和筛选方法。

本发明的hEGF工程菌构建过程如下：

一、通过PCR技术获得包含卡那霉素抗性基因，通过化学合成方法获得大肠杆菌cspA基因功能元件；

二、对编码SUMO蛋白的基因和编码hEGF的基因序列，按照大肠杆菌的密码子偏好性，进行密码子优化，获得适合在大肠杆菌中大量表达的序列OPT-SUMO-hEGF；

三、将第一步和第二步所得的片段连入pET21质粒中，得到pET-Kan-cspA-SE质粒；

四、以pET-Kan-cspA-SE质粒为模板，构建转座体；

五、将转座体转入大肠杆菌Origami 2(DE3)；

六、筛选出高表达SUMO-hEGF的菌株；

其中步骤二中根据大肠杆菌偏爱密码子设计的大量表达重组hEGF的优化序列OPT-SUMO-hEGF如序列表中SEQ ID NO：3所示。

本发明的重组hEGF工程菌同已有文献报道的重组hEGF工程菌相比，具有以下优点：(1)本发明采用转座反应，将编码hEGF的基因整合于大肠杆菌的基因组中，由于没有使用质粒，从根源上避免了发酵条件中由于质粒丢失而导致的产量下降的问题，极大的提高了工程菌的稳定性；(2)本发明采用大肠杆菌抗冻基因cspA的功能元件，低温诱导表达hEGF，显著的提高了hEGF表达的可溶率；此外，低温诱导有利于保证hEGF的同质性，从一定程度上简化了后续的纯化操作。综上所述，按本发明所述方法得到的菌株基因组稳定、表达的人表皮生长因子可溶率高，适合大规模工业化生产。

附图说明

图1为cspA基因功能元件排列顺序图

图2为pET-kan-cspA-SE质粒物理图谱

图3为高可溶表达菌株SE-26摇瓶培养后表达SUMO-hEGF的结果。图中1道为诱导前的样品，2道为低温诱导48小时后的全菌蛋白，3道为低温诱导48小时后超声破碎菌体并离心后的上清。

具体实施方式

本发明的重组hEGF工程菌构建具体过程如下：

1.包含卡那霉素抗性基因和cspA基因功能元件的构建