[发明专利]PCR-焦磷酸法检测副溶血弧菌的检测引物、试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及PCR-焦磷酸法检测副溶血弧菌的检测引物、试剂盒和检测方法。

背景技术：

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一种引起食源性疾病的重要病原，在近年来沿海地区的食物中毒病例中，该菌已成为首要病原。随着分子生物学的发展，已有用普通PCR或荧光PCR检测VP的报道，虽然这些方法可达到快速、高通量的目的，但却无法获得分子诊断的黄金标准-基因序列，因此有出现假阳性的可能。副溶血性弧菌的分子检测方面，以tdh基因为目的基因判断其有无致病性非常实用，但tdh基因家族广泛存在于人类致病性弧菌中，如大多数霍利斯弧菌，某些拟态弧菌，非O1群霍乱弧菌等，因此，用tdh检测VP存在一定的局限性。以tlh为目的基因也可能出现同样的情况，Robert Pillot等的研究发现，溶藻弧菌和副溶血性弧菌的同源性非常高，靶定tlh基因的引物不能用于两者的鉴别。Croci等评估了不同靶基因的副溶血性弧菌的PCR鉴定方法，指出toxR作为靶基因的PCR具有最高的准确性，该基因可作为VP分子鉴别的参考方法。

焦磷酸测序（pyrosequencing）技术是近年来发明的一项实时地进行短片段DNA测序技术，其是一种基于合成的新型DNA测序技术，在特异引物的引导下，根据待测序列分别加入四种核苷酸，在延伸的过程中释放焦磷酸，后者在ATP硫酸化酶和荧光酶的偶联反应中释放荧光，通过检测器检测相应的荧光强度，从而获得检测样本中的核苷酸序列，是一种非常实用的短序列实时检测技术，已应用于临床微生物的分型鉴定及耐药监测，其定量准确、易于自动化、能实现高通量的大样本的快速检测，具有DNA测序法无法比拟的优势，由于该技术在DNA序列分析时不需要电泳和荧光标记，直接测定测序引物后面的碱基序列，通过提供可靠的序列信息来确认PCR产物，同时由于主要分析PCR产物双链中的一条链的序列，避免了由于DNA链的二级结构造成的人工假象，使测序结果更加准确。

发明内容：

本发明的目的是提供简便、快捷、准确性高、特异性强的PCR-焦磷酸法检测副溶血弧菌的检测引物、试剂盒和检测方法。

本发明根据VP的toxR基因(GenBank:AB063113)，设计扩增引物和测序引物，建立了结合PCR-焦磷酸测序从DNA碱基序列水平上检测VP的方法，从而实现了本发明的目的。

本发明的PCR-焦磷酸法检测副溶血弧菌的检测引物，其特征在于，包括PCR引物和测序引物：

PCR引物：上游引物F：GAGATTCCGCTGGGTTTGTAA；（如SEQ ID NO.1所示）

下游引物R：TGAACCAGAAGCGCCAGTAGTAC；（如SEQ ID NO.2所示）

测序引物S：AAATAACGCGTGGAAT（如SEQ ID NO.3所示）。

本发明的第二个目的是提供PCR-焦磷酸法检测副溶血弧菌的检测试剂盒，包括DNA提取试剂，PCR反应试剂，单链模板制备试剂，焦磷酸测序试剂，PCR引物和测序引物，其特征在于，所述的PCR引物和测序引物为：

PCR引物：上游引物F：GAGATTCCGCTGGGTTTGTAA；（如SEQ ID NO.1所示）

下游引物R：TGAACCAGAAGCGCCAGTAGTAC；（如SEQ ID NO.2所示）

测序引物S：AAATAACGCGTGGAAT（如SEQ ID NO.3所示）。

本发明的第三个目的是提供非诊断目的的PCR-焦磷酸法检测副溶血弧菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；

（2）使用上述PCR引物进行PCR反应，回收PCR产物，制备单链模版，然后应用上述测序引物对PCR产物进行焦磷酸测序，自测序引物3^/端后的第一个碱基开始测序，测序引物后的34个碱基序列为CCAAGGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTT TT时，判断样品中含有副溶血弧菌。

优选，所述的PCR反应，其扩增体系50μL，PCR Mix Buffer 25μl，Taq酶5μl，MgCl₂1μl，10μM上、下游引物各2μl，DNA模板1μl，去离子水14μl，所述的PCR反应条件为预变性95℃4min；95℃15s，65℃30s,，72℃30s，43个循环；72℃12min。