[发明专利]黄鳝芳香化酶保守区的原核表达载体pMAL-Arom19及其构建方法和应用方法

权利要求书

1.黄鳝芳香化酶保守区的原核表达载体pMAL-Arom19，其特征在于：所述原核表达载体由表达载体pMAL-c2x构建而得，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点PBS、Arom19基因保守区序列及一个麦芽糖结合蛋白标签序列。

2.如权利要求1所述的原核表达载体pMAL-Arom19，其特征在于：所述载体中的Arom19来源于黄鳝。

3.如权利要求1所述的原核表达载体pMAL-Arom19，其特征在于：所述Arom19基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠Arom19基因的起始密码子上游还有一个麦芽糖结合蛋白标签序列。

4.如权利要求1~3中任一项所述的原核表达载体pMAL-Arom19的构建方法，其特征在于由下述方法构建而得：

从GenBank中查找黄鳝Arom19的全长基因序列，并采用Primer5.0设计一对特异性引物：

上游引物1： 5'- CAGTGTGTGTTGGAGATGGTGA-3′

下游引物2： 5'- TTCATCATCACCATGGCAATGT -3′

以提取自黄鳝的脑总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA，以反转录产物为模板及合成的上下游引物进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸7min；

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后用凝胶回收试剂盒回收，将回收产物与pMD18-T载体，16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109，随机挑取细菌，提取质粒后用EcoRⅠ、HindⅢ双酶切初步鉴定后，将阳性克隆进行DNA测序，测序结果用生物软件DNAstar、CLUSTAL X等进行分析；

将阳性质粒和原核表达质粒pMAL-C2X分别用EcoRⅠ、HindⅢ 37℃双酶切，用凝胶回收试剂盒回收Arom19保守区片段和线性化pMAL质粒，按照T4 DNA连接酶的说明书设计连接反应体系，构建表达质粒pMAL-Arom19，并转化大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆，随机挑取1-2个克隆进行酶切鉴定，获得黄鳝芳香化酶保守区的原核表达载体pMAL-Arom19。

5.如权利要求1~3中任一项所述的原核表达载体pMAL-Arom19在制备Arom19保守区抗体的抗原中的应用。

6.用权利要求1~3中任一项所述的原核表达载体pMAL-Arom19在制备Arom19重组蛋白中的应用，其具体应用方法如下：

将pMAL-Arom19转化大肠杆菌TB1，挑取阳性克隆接种含50μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇振培养过夜；

取培养菌液以1/10的比例接种于新鲜的含氨苄青霉素的LB液体培养基中，分别以0.5、1mol/L浓度的IPTG诱导，37℃摇振培养4h后，收集菌体，加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL，冰浴30min；

加入DNA酶和RNA酶至终浓度为5μg/mL，4℃孵育10 min；所得产物9000g离心30 min，将上清转移备用，上清即为表达的融合蛋白；

将上清蛋白质上样于平衡缓冲液平衡好的Amylose-sepharom19se亲和柱中，其中所述平衡缓冲液为20mmol/LTris-HCL, 200mmol/LNaCl, 1mmol/LEDTA, pH7.4；

用缓冲液平衡至基线后，开始用洗脱缓冲液，所述洗脱缓冲液为平衡缓冲液，再加10mmol/L麦芽糖，洗脱液中即为纯化后的融合蛋白；

最后SDS-PAGE电泳检测；在纯化好的蛋白中加入Factor Xa至终浓度为200μg/mL，室温作用4h，同上过Amylose- sepharom19se亲和柱，用平衡缓冲液洗脱下的即为Arom19蛋白。