[发明专利]黄鳝芳香化酶保守区的原核表达载体pMAL-Arom19及其构建方法和应用方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种高效表达黄鳝芳香化酶保守区蛋白（Arom19）的原核表达载体pMAL-Arom19及其构建方法，以及在Arom19保守区蛋白的原核表达和制备抗Arom19多克隆抗体中的应用，及其具体应用方法。

背景技术

芳香化酶 (Aromatase 19，Arom19)是类固醇激素代谢中的一种重要酶类，属于细胞色素P450家族中的一员，广泛存在于大多数脊椎动物的脑和垂体中，它可催化某些雄激素转化为雌激素，是雌激素生物合成中的关键酶和限速酶。研究表明，芳香化酶可以影响哺乳动物中枢神经系统的功能和发育，调节神经内分泌和繁殖功能以及性行为，并参与非哺乳动物性腺分化的调控，很多实验已证实芳香化酶可控制多种鱼类的性别分化和性别转化。迄今为止，已从虹鳟、鲫、斑马鱼、日本鳗鲡等淡水硬骨鱼和牙鲆、欧洲舌齿鲈等海水硬骨鱼类的卵巢中克隆出性腺芳香化酶基因，甚至软骨鱼类大西洋中的芳香化酶基因也被克隆。此外，在金鱼、斑马鱼、虹鳟等鱼类中已克隆出芳香化酶基因的第二种形式——脑芳香化酶，舌齿鲈脑中较低的芳香化酶活性也暗示着在这种鱼可能也存在着芳香化酶的第二种基因形式。Andersen与Riley等研究了抗虹鳟Arom19的免疫接种，提出了一种有望控制鱼类性成熟的方法，认为免疫抑制技术在控制虹鳟生殖方面有一定的应用潜力。

黄鳝(Monopterus albus)，俗称鳝鱼，属于硬骨鱼纲、合鳃目、合鳃科、黄鳝属，广泛存在于亚洲地区，中国仅产1 种。其体型细，形状似蛇或鳗，营养价值极高。在黄鳝的生活史中存在着特殊的生殖发育现象——自然性逆转。研究表明，第一次性成熟发育周期内黄鳝为雌性发育，雌性性成熟产卵后，生殖腺内卵细胞败育，卵巢结构逐步退化，同时雄性生殖细胞开始发育，通过雌雄间性阶段过渡到雄性发育。黄鳝性逆转在基因水平上的调控以及性别决定基因一直是研究者们关注的热点，而性别决定又是一个涉及进化时空的多基因活动的复杂调控过程。因此对性激素具有调节作用的芳香化酶研究具有一定的生产意义。高效表达芳香化酶基因的重组载体的制备可以高效获取重组蛋白，可以满足其在鱼类人工繁殖中的运用，同时制备的抗体在现有研究中还未见有报道。

发明内容：

发明目的：本发明的目的是提供一种Arom19的原核表达载体pMAL- Arom19，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点RBS和Arom19基因保守区序列及一个麦芽糖结合蛋白标签；利用该载体转化大肠杆菌，可实现Arom19蛋白的高水平表达，表达的重组蛋白质以可溶性形式存在于上清中（占大肠杆菌可溶性总蛋白43.8%），通过亲和层析纯化很容易获得高纯度的重组蛋白质，用于蛋白质的制备。纯化Arom19蛋白的操作相当简单，成本也不高，极易重复使用。

技术方案：为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

本发明提供一种黄鳝芳香化酶保守区的原核表达载体pMAL-Arom19，该载体由表达载体pMAL-c2x构建而得，含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点PBS、Arom19基因保守区序列及一个麦芽糖结合蛋白标签序列。

作为本发明一种方案，所述载体中的Arom19来源于黄鳝。

进一步说明所述原核表达载体pMAL-Arom19，其特征在于：所述Arom19基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠Arom19基因的起始密码子上游还有一个麦芽糖结合蛋白标签序列。

本发明还提供所述的原核表达载体pMAL-Arom19的构建方法，包括如下步骤：

（1）从GenBank中查找黄鳝Arom19的全长基因序列，并采用Primer5.0设计一对特异性引物：

上游引物1： 5'- CAGTGTGTGTTGGAGATGGTGA-3′

下游引物2： 5'- TTCATCATCACCATGGCAATGT -3′

以提取自黄鳝的脑总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA，以反转录产物为模板及合成的上下游引物进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸7min；