[发明专利]一种抗菌剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域。特别涉及一种抗菌剂及其制备方法。

背景技术

抗生素是用于治疗各种细菌感染或抑制致病微生物感染的药物。重复使用一种抗生素可能会使致病菌产生耐药性。目前，人们对抗生素的高使用频率和高使用剂量使得细菌耐药性问题越来越突出。为防止和减少致病菌耐药性的产生，一方面我们应坚持合理用药，杜绝滥用抗生素，另一方面要不断改进和研制新的抗菌药物。

抗菌肽是广泛分布于生物体内的一类多肽分子，分子量通常为2000~7000Da左右，由20~60个氨基酸残基组成。抗菌肽具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，尤其是其对某些耐药性病原菌的杀灭作用更引起了研究者的关注。另外，人们还发现，某些抗菌肽对部分病毒、真菌、原虫和癌细胞等具有杀灭作用，甚至能提高免疫力、加速伤口愈合等过程。因此，抗菌肽的广泛的生物学活性显示了其在医学上良好的应用前景。

抗菌肽在自然界中广泛存在，人们相继从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物乃至人类中发现并分离获得了抗菌肽。但目前抗菌肽的提取过程费时、工艺复杂、费用昂贵、产量低，无法实现大规模生产，这成为制约抗菌肽进入实际应用的最大障碍。因此，开展抗菌肽基因工程研究具有重要意义。目前，已进入临床应用的基因工程药物多数是采用原核表达系统生产的，但由于抗菌肽对细菌的杀伤作用，不能用原核表达系统直接表达具有生物活性的抗菌肽。国内研究者大量研究表明，利用酵母表达抗菌肽是一条可行的道路，但表达产率仍有待进一步提高。

芋螺毒素（conotoxin，CTL）是由海洋软体动物芋螺（Conus）分泌的一类用于自卫和捕食的活性肽类毒素，能特异性地作用于钾、钠、钙等离子通道、细胞膜上的各种神经递质和激素的受体，从而干扰细胞或神经中的信号传递。芋螺毒素分子质量小，通常由10~30个氨基酸残基组成。研究发现，尽管芋螺毒素种类繁多，序列多变，但它们的信号肽序列却非常保守。同时，成熟肽中富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架。1992年，Eldridge 等人在苜蓿尺蠖核型多角体病毒（Autographa californica  multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）中发现了一种与芋螺毒素结构非常类似的小分子肽，根据其保守的结构特点命名为类芋螺毒素（conotoxin-like，CTL）。序列比对发现，在目前已测序的杆状病毒中超过三分之一的病毒含有ctl基因。但到目前为止，还没有研究揭示其在体内和体外的任何功能。

我们利用PCR技术从AcMNPV中克隆到ctl基因，进而构建重组杆状病毒，感染离体昆虫细胞后，发现胞外产物对金黄色葡萄球菌、微球菌、短小芽孢杆菌等多种临床致病菌具有抑制活性，在医药、食品等领域具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗菌剂及其制备方法。

本发明公开了一种含有ctl基因、Pie1启动子的中间载体pFastBac-Pie1-ctl，它的结构如图2所示。所述中间载体pFastBac-Pie1-ctl是通过下述方法构建得到：

（1）根据苜蓿尺蠖核型多角体病毒（AcMNPV）的ctl基因设计一对引物，以AcMNPV基因组DNA作为模板进行PCR扩增，反应条件为： 94℃ 4min； 94℃ 20s，62℃ 30s，72 ℃ 30s, 30个循环；72℃ 7min。琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收，将ctl基因连入pMD18-T 形成重组质粒pMD18-T-ctl；

（2）利用SnaBI和BamHI将家蚕核型多角体病毒（BmNPV）的Pie1启动子取代pFastBac1上原有的多角体基因启动子，得到pFastBac1-Pie1；用BamHI和KpnI切割重组质粒pMD18-T-ctl，回收ctl片段，克隆到经同样双酶切的pFastBac1-Pie1，将ctl基因置于Pie1启动子下游，构建出中间载体pFastBac-Pie1-ctl。

本发明所述抗菌剂，通过以下步骤制备得到：

（1）制备含有类芋螺毒素（ctl）基因的中间载体pFastBac-Pie1-ctl，所述中间载体包括来自家蚕核型多角体病毒（BmNPV）早期启动子Pie1、来自苜蓿尺蠖核型多角体病毒（AcMNPV）的ctl基因；