[发明专利]一种重组人促卵泡激素的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，具体涉及一种重组人促卵泡激素的纯化方法，属于生物技术领域。

背景技术

卵泡刺激素（Follicle Stimulating Hormone，FSH）也称为促卵泡激素，是一种属于促性腺激素类的可注射的蛋白质。天然状态下由垂体嗜碱性细胞合成和分泌的，作为药用，FSH可以重组产生，或者可以从绝经后的妇女尿液中分离得到。FSH可用于女性和男性病人的不孕和生殖紊乱的治疗，目前国内已经上市的有从尿液中提取的注射用尿促卵泡激素，商品名丽申宝；采用基因重组技术生产的产品也已进口上市，其纯度更高、避免了尿蛋白杂质及其他杂质的污染，商品名果纳芬（重组人α促卵泡激素）和普丽康（重组人β促卵泡激素）。

FSH是一种糖蛋白，糖蛋白激素的不均一性引起理化性质的差别较大，对色谱分离方法的选择性提出了挑战——既要保证制品的质量，又要有较高的回收率，这是蛋白质纯化中一个重要的问题。

CN101087805中公开了一种重组FSH纯化方法，该发明采用超滤、阴离子交换层析、染料亲和层析、疏水层析、反相层析以及阴离子交换层析的方法纯化重组FSH。CN1890265中公开了一种重组FSH纯化的方法，该发明采用超滤、阴离子层析、金属螯合亲和层析、阴离子层析、疏水层析以及反相层析的方法纯化FSH，制备的FSH比活性为8876IU/mg。这两篇专利所涉及的纯化工艺步骤较多，纯化较为复杂，工业化生产过程中控制点多，对纯化工艺可控性带来一定的困难；另外，反相层析过程相对较慢，需要用到有机溶剂，最终导致产物要检测有机物残留，而且以后用于医药生产时还要考虑有机溶剂的存放问题，给医药生产带来一定的不便。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种适宜于规模扩大化生产的、快速、高效、简便的重组人促卵泡激素目的蛋白的纯化方法，具有工艺简单、成本低，目的产物纯度高以及中间过程便于控制和易于规模化放大生产等特点。

本发明将含有重组人促卵泡激素的液体依次经过染料亲和层析、疏水作用层析、脱盐层析和羟基磷灰石层析得到高质量的重组人促卵泡激素目的蛋白。

本发明的具体步骤为：

染料亲和层析

（1）用平衡缓冲液对染料亲和层析柱进行平衡，将含重组人促卵泡激素目的蛋白的细胞培养上清进行上样，重组人促卵泡激素目的蛋白吸附于染料亲和层析介质上；

（2）用含有NaCl的平衡缓冲液对步骤（1）处理的层析柱进行洗脱，使重组人促卵泡激素目的蛋白穿出染料亲和层析柱，收集洗脱蛋白液；

疏水作用层析

（3）用含盐的平衡缓冲液对疏水层析柱进行平衡，将步骤（2）中的洗脱蛋白液进行上样，使重组人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水层析柱，收集穿出蛋白液；

脱盐层析

（4）将步骤（3）中的穿出蛋白液上样到用平衡缓冲液平衡好的脱盐柱上进行脱盐，收集脱盐的蛋白液；

羟基磷灰石层析

（5）用平衡缓冲液对羟基磷灰石层析柱进行平衡，将步骤（4）中收集的蛋白液上样到羟基磷灰石层析柱上，重组人促卵泡激素目的蛋白穿出并收集，即获得目的蛋白原液。

本发明所采用的含重组人促卵泡激素目的蛋白的细胞培养液在纯化之前先进行澄清过滤，除去细胞培养液中的菌体等成分。

染料亲和层析过程中，介质选用Blue Sepharose CL-6B、Blue Sepharose 6Fast Flow或者Blue Sepharose High Performance，该过程主要用于捕获细胞培养液中的重组人促卵泡激素目的蛋白，同时除去少量杂质蛋白，而且染料亲和层析洗脱液不用经过样品处理就可以直接进行后续的疏水层析，简化了操作步骤。当重组人促卵泡刺激素目的蛋白吸附于染料亲和层析介质上后采用添加了NaCl的平衡缓冲液对其进行洗脱，其中NaCl的浓度为1.0mol/L-2.5mol/L。

本发明各个步骤所用的平衡缓冲液为本领域常用的缓冲体系，例如Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液或Hepes缓冲液，缓冲液浓度为10mmol/L-100mmol/L，pH值为6.5-10.0。