[发明专利]水产养殖鲇鱼杂种的CH4分子标记DGGE鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类杂种的分子标记鉴定方法，具体涉及水产养殖鲇鱼杂种的CH₄分子标记DGGE鉴定方法。

背景技术

鲇形目鱼类属肉食性底层鱼类，是鱼类进化中最发达的真骨鱼类之一。南方鲇（又叫大口鲇）（Silurus meridionalis Chen）和鲇（Silurus asotus Linnaeus）均属于鲇形目、鲇科、鲇属，两者味道鲜美、营养价值高，是我国各地主要养殖的高附加值经济鱼类。南方鲇分布于我国珠江、闽江、湘江、长江等水系，是一种大型凶猛的肉食性鱼类，具有生长快、个体大、抗病力强等特点，喜栖息于开敞水体，以及湾沱、河底砾石河段，怀卵量大，产卵期长。鲇分布于除青藏高原及新疆外的全国各水系，体色随栖息环境不同而有所变化，主要栖息于江河干流或较大的支流、大型湖泊和水库等水体的中下层，其适应性强，栖息于静水或缓流水域，个体较小，生长快。南方鲇和鲇形体轮廓相似，小个体的南方鲇与鲇成体混同杂居，大个体与鲇隔离生活。据报道，人工繁殖的南方鲇群体中雄性比例非常低。调查显示，当雄性南方鲇缺乏时，可能进行了雌性南方鲇与其他雄性鲇属种类的杂交，从而在鲇鱼生产中出现了物种间的杂交育种。

为了满足社会生产的需要，获得兼有以上2种鱼优良性状的苗种，王朝明等（大口鲇与鲇鱼的杂交试验，淡水渔业，2004，34（6）: 41~43；三种鲇遗传多样性的RAPD分析，淡水渔业，2005，35（4）: 14~17）开展了南方鲇与鲇的杂交育种试验，并做了一定的杂种鉴定工作，筛选出22个随机引物用于南方鲇、鲇及其杂交F₁代三个群体多样性分析，结果发现杂交F₁代继承了大口鲇的52条特征带和鲇的32条特征带。然而，其鉴定工作所采用的RAPD标记，受方法本身的限制，检测效率低且重复性不高，严重影响了这一方法的推广使用。此外，仅有龙华等（鲇、大口鲇及其杂交鲇血液生理生化指标比较及转铁蛋白等位基因分析，长江大学学报（自科版），2006，3（2）: 161~164； 鲇、大口鲇及其杂交鲇的血型分析，水利渔业，2007，27（3）: 19~20）对南方鲇、鲇及其杂交鲇的血液生理、血型分析及同工酶等方面的研究。可见，有必要开展南方鲇、鲇及其杂交子代的分子标记及鉴定技术研究，为南方鲇养殖和育种实践中的杂种鉴定提供可靠方法。

目前，RAPD、AFLP和微卫星都适合种群层次的种质鉴定，但是，RAPD检测效率低，通常尝试数十对随机引物才有十对左右可以使用，而且重复性不佳；AFLP重现性较高，能产生大量（通常100以上）的多态性条带，但不易操作，在放大种间差异的同时更加剧了种内差异，存在大量假阳性结果，限制了杂种鉴定准确性；微卫星虽然具有种属特异性、共显性及高度的多态性和灵敏性，在杂种鉴定及遗传渐渗等分析中得到了广泛的应用，但是用于鉴别杂种的位点需要具种属特异性，在分析过程中要判断扩增产物的真实性，尤其是在鉴别近缘种杂交时，正确判断近缘种中等位基因的大小和数目显得特别重要，这在很大程度上增加了微卫星的使用难度。

变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术广泛应用于微生物宏基因组种属的鉴定，还从未被引入杂种鉴定领域。变性梯度凝胶电泳是一种在核苷酸序列中发现点突变或SNP位点的方法，这种电泳技术直接依据DNA序列差异产生的变性条件的不同而进行，即依据片段长度相同但碱基组成不同的DNA分子在含有线性变性剂梯度的构象胶中迁移率不同而可以相互分离。通过DGGE可以分离长度在500 bp以内的具有50 %序列差异的DNA片段，而在给DNA片段的一端加上高GC含量的夹板后，甚至可以分离序列差异仅有1 bp的DNA片段。在杂种鉴定领域，使用这种方法能在找到存在差异位点核基因的同时将其等位基因进行分离，进而在胶图上直观地判定物种是否存在杂交，从而提高了杂种鉴定的快捷性，并在一定程度上克服了琼脂糖凝胶或普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳中不能进行等位基因分离鉴别的缺陷。

发明内容

本发明的目的为鉴定南方鲇与鲇的杂种，从分子生物学层面上将形态上不易区分的杂种和纯种进行分辨。本发明以南方鲇、鲇及其杂交子代为研究对象，在鲇属鱼类中筛选设计了CH₄基因片段作为分子标记，应用CH₄基因片段的变性梯度凝胶电泳（DGGE）检测，成功鉴定了南方鲇、鲇及其杂交子代。