[发明专利]一种高F值金枪鱼寡肽制备方法

说明书

技术领域

本发明属于寡肽制备技术领域，具体涉及一种高F值金枪鱼寡肽制备方法。

背景技术

金枪鱼(Tunas) 又叫鲔鱼、吞拿鱼，属鲈形目(Perciformes)鲭科(Scombridae)，作为一种深海鱼类，金枪鱼不仅肉味鲜美，而且营养价值非常高，富含蛋白质、不饱和脂肪酸和维生素，以“纯天然、营养价值高”而享誉国际市场。金枪鱼的主要加工种类有蓝鳍金枪鱼、长鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼和大眼金枪鱼。浙江省是我国金枪鱼加工中心，拥有全国最大的金枪鱼加工基地，金枪鱼除了鲜销外，其加工产品的附加值非常高，一般经过冷冻处理用于制作寿司及罐装食品。金枪鱼在加工过程中产生大量碎肉，这些碎肉同金枪鱼的鱼肉主体一样营养丰富，目前尚无有效的工业化深加工方法。 

高F值寡肽是由3～7个氨基酸残基所组成的混合小肽混合物，F值是指混合物中支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，简称BCAA）和芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸，简称AAA）的摩尔比值，是为了纪念德国著名学者Fischer 在上个世纪70年代提出的“伪神经传递质假说”而命名的。小肽分子与游离氨基酸相比具有渗透压低、抗原性低等优点，所以更容易被吸收。研究表明高F值寡肽能够改进肝脏疾病（肝硬化、肝性脑病），常被用于辅助治疗肝性脑病以及改善手术后和卧床病人的蛋白质营养状况，另外，高F值寡肽还具有抗疲劳和醒酒等多种生物活性。但是，相对于水产蛋白及加工副产物蛋白水解液的抗氧化肽和ACE降压肽研究而言，水产蛋白高F值寡肽的研究还较少，而以金枪鱼碎肉为原料制备高F值寡肽的研究还未见报道。

目前高F值寡肽制备主要采用二步酶解法，第一步酶切：在原料蛋白肽链的芳香族氨基酸处切割使芳香族氨基酸暴露出来；第二步酶切：将芳香族氨基酸切掉，释放到水解液中为游离型，使寡肽剩下含量高的支链氨基酸。所以，酶解法制备高F值寡肽关键点之一是要选择特异性蛋白酶，提高酶解效率，释放芳香族氨基酸。

获得高F值寡肽关键点之二是要最大限度地去除蛋白水解液中芳香族氨基酸，提高支链氨基酸与芳香族氨基酸的比值（F值>20）。蛋白质水解液中的芳香族氨基酸去除方法很多，如离子交换法、凝胶过滤法、膜分离法、活性炭吸附色谱法等，其中活性炭对苯丙氨酸、酪氨酸有选择性吸附特性，利用这一特性，可将寡肽和芳香族氨基酸分离，而且从工业应用角度考虑，活性炭吸附法更易推广使用，适合大规模生产。

现有的活性炭吸附法都采用活性炭静态吸附法，在酶解液中直接加入活性炭进行吸附，这种方法洗脱效果有限，酶解液中有较多的活性炭残留，吸附使用过的活性炭再生困难。

 

发明内容

本发明的目的在于提供一种高F值金枪鱼寡肽的制备方法，具有良好的酶解效率，适用于工业化生产。 

本发明的具体技术方案是：  

一种高F值金枪鱼寡肽的制备方法，其特征在于该制备方法包括以下步骤：

预处理：称取解冻后的金枪鱼碎肉，采用匀浆机匀浆两分钟，直到无大块鱼肉为止，然后按一定比例w/v=1:7加入蒸馏水，放在反应器中，35°C保温；

固定化酶制备：

称取一定量的壳聚糖，用2%乙酸溶液至完全溶解，用注射器将制备好的壳聚糖凝胶按1:3 90%乙醇溶液中，凝结2h，加入5%戊二醛，开动磁力搅拌器，在150rpm转速下振荡1h，用去离子水充分洗涤，至无戊二醛残液，得到交联好的载体；

在交联好的载体中，加入一定量由pH 3.0的乳酸-乳酸钠配置的胃蛋白酶溶液，于4℃冰箱中交联10h，用蒸馏水洗涤，布氏漏斗抽滤得到固定化胃蛋白酶；

在交联好的载体中，加入一定量由蒸馏水配制的木瓜蛋白酶溶液，于4℃冰箱中交联10h，用蒸馏水洗涤，布氏漏斗抽滤得到固定化木瓜蛋白酶；

将固定化胃蛋白酶和固定化木瓜蛋白酶装配于一个两层筒状酶反应器中，该酶反应器由上下两层旋转筐连接而成，将固定化胃蛋白酶装配在上面一个旋转筐夹层中，将固定好的木瓜蛋白酶装在下面一个旋转筐夹层中；

酶解：让反应液依次流过这两个旋转筐，所述旋转筐内部设有主轴带动叶轮转动，使酶解液与固定化酶发生相对运动，利于固定化酶与酶解液充分接触；

其中，第一步酶解条件如下：调节反应液pH至2.0，放入上层旋转筐内进行酶解，酶解温度为40℃，每隔半小时调节一次pH值，让酶解液保持在pH2.0下进行酶解，酶解时间为4小时；