[发明专利]一种猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗，同时还涉及一种该疫苗的制备方法，同时还涉及一种构建人工基因YSORF及融合蛋白rYSORF。

技术背景

猪圆环病毒病（PCV）是由猪圆环病毒2型（PCV2）引起的猪传染性疾病，是继猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）之后新发现的又一重要疫病。自1997年Clark等首次分离到猪圆环病毒2型（PCV2）以来，该病已给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。目前，如何有效防控PCV已成为全球养猪业关注的焦点。

迄今，全球有4种商品化PCV2疫苗相继问世，其中梅里亚动物保健公司研发的PCV2疫苗为全病毒灭活苗，适用于母猪免疫。由于PCV2难培养、生长慢，考虑到病毒培养成本高、周期长，人们又摸索出了一些新的方法来制备PCV2仔猪用疫苗，主要包括两种类型：一类是亚单位疫苗，如勃林格殷格翰动物保健公司的PCV2疫苗和英特威/先灵葆雅动物保健公司的PCV2疫苗大量田间试验表明该类疫苗可为仔猪提供良好的免疫保护；另一类是嵌合病毒灭活苗，用PCV2的ORF2片段置换不致病的PCV1中的ORF2片段，即获得了PCV1-PCV2嵌合病毒，具有与PCV2类似的免疫原性。近年来，以上PCV2疫苗已在部分国家和地区进行了注册，并在该病的防治过程中发挥了重要的作用。然而，目前我国尚无注册及国产的PCV2商品化疫苗，临床上急需针对PCV2的安全、保护力高的疫苗。

基因工程疫苗如DNA疫苗、亚单位疫苗及病毒活载体疫苗等将是研制PCV2疫苗的主要方向。猪2型圆环病毒含有两个主要的开放阅读框:ORF1和ORF2，其中ORF1与病毒复制有关，免疫原性和保护力弱；ORF2为PCV2的主要结构蛋白基因，编码病毒的衣壳蛋白,可自我装配成病毒样粒子，是病毒的主要免疫原性蛋白，并且McNeilly等(McNeilly F etal.,Archires of Virology,2001)研究证实ORF2中含有可中和病毒的中和抗原表位，是亚单位疫苗研制的主要候选基因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗。

本发明的目的还在于提供一种猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗的制备方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种猪圆环病毒的2型重组亚单位疫苗，所述的亚单位疫苗主要由猪圆环病毒2型融合蛋白rYSORF和佛氏不完全佐剂组成。

所述的融合蛋白rYSORF中加入的佛氏佐剂是佛氏不完全佐剂，先将纯化后的融合蛋白调至1mg/ml，按佛氏不完全佐剂与融合蛋白的体积比为1:1在搅拌状态下加入。

同时，本发明的技术方案还采用了一种猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗的制备方法，所采用的技术方案包括下述步骤：

1）构建人工基因YSORF:

选取猪圆环病毒2型ORF1和ORF2蛋白免疫优势区，利用生物信息学优化密码子，形成人工基因序列，命名为YSORF；设计引物，利用重叠PCR(SOE)技术拼接YSORF，该序列包含柔性肽(G₃S)₅，连接ORF1和ORF2蛋白免疫优势区；然后利用生物信息学软件Vector NTI对该序列进行密码子优化，获得人工基因YSORF序列；

2）构建重组表达载体rYSORF；

3）融合蛋白rYSORF的诱导表达；

在TB液体培养基中诱导表达，优化表达条件促进融合蛋白在上清中表达；

4）分离纯化大肠杆菌表达的猪圆环病毒2型重组蛋白；

5）利用纯化的猪圆环病毒2型融合蛋白，辅以适量的佛氏不完全佐剂，制备成猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗。

所述步骤3）中融合蛋白rYSORF表达条件的优化是将含有人工基因YSORF的工程菌按1/500接种液体TB培养基，37℃剧烈振荡培养至OD600≈1.0时，加入诱导剂IPTG至0.05mM和表面活性剂SDS至0.05%，40℃诱导培养6小时，获得可溶性融合蛋白rYSORF。

所述的构建人工基因YSORF序列包含序列表中SEQ IDNO.1、SEQIDNO.2和SEQ IDNO.3，且分别位于人工基因YSORF序列的上游、中部和下游。

所述的融合蛋白rYSORF序列包含序列表中的SEQ IDNO.4、SEQ IDNO.5和SEQ IDNO.6，且位于融合蛋白rYSORF序列氨基端、中部和羧基端。