[发明专利]一种捕获核酸片段的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种捕获核酸片段的方法。

背景技术

随着第二代高通量测序技术的出现和发展，目前，科学家们已经能够对很多生物物种的基因组进行常规的从头测序，并对这些物种的基因组中的重要部分进行再测序。但是，在广泛应用的第二代高通量测序技术的成功使用过程中存在一个主要瓶颈：即如何快速有效的将散落于基因组、线粒体和/或其他形式的DNA中的特定区域的核酸片段选择性的捕获出来。选择性捕获并富集来自生物物种的基因组、线粒体和/或其他形式的DNA的特定区域具有广泛的应用。

现有技术中主要是通过微阵列技术捕获特定区域的核酸片段，方法如下：1）在微阵列芯片上通过化学合成直接生成与目的片段互补的DNA片段；2）利用带T7 promoter的引物对步骤1）所得的DNA片段进行PCR扩增，然后对PCR产物进行逆转录，转录体系中加入了带有生物素标记的dUTP，生成带有生物素标记的RNA片段（捕获探针）；3）将片段化后的基因组DNA与带有生物素标记的RNA片段混合孵育，使得目的DNA片段与RNA结合，提取纯化得到目的DNA片段。该方法中，带有生物素标记的RNA片段的生物素标记是在逆转录过程中通过带生物素标记的dUTP引入的，生物素标记的数量和位置是随机的，捕获探针的均一性不好，可能导致获得的捕获探针中的部分探针上的生物素标记过多和/或位置不当，影响其与基因组DNA的杂交，进而导致对目的DNA片段的捕获效果不佳；此外，本方案在制备捕获探针的过程中需要在芯片上化学合成与目的片段互补的DNA片段，生产成本高。

因此，需要一种新的捕获核酸片段的方法，能够避免因为捕获探针的均一性差而导致的捕获效果不佳的现象的发生，并降低捕获核酸片段的成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的捕获核酸片段的方法，旨在解决现有技术中因为捕获探针的均一性差而导致捕获效果不佳的问题。

为了实现发明目的，本发明提供了一种捕获核酸片段的方法，包括以下步骤：

A.以含待捕获核酸片段的核酸分子为原料，利用生物素标记的扩增引物或接头元件制备生物素标记的捕获探针；

B.使生物素标记的捕获探针与待捕获核酸片段库杂交，利用含链霉亲和素或亲和素标记的固相载体捕获所述待捕获核酸片段。

其中，所述步骤B可包括以下步骤：

B01.利用含链霉亲和素或亲和素标记的固相载体捕获步骤A中的生物素标记的捕获探针，得固定在固相载体上的捕获探针；

B02.使固定在固相载体上的捕获探针与待捕获核酸片段库杂交得第一次杂交产物，分离纯化第一次杂交产物得含固相载体的第一产物；

B03.使步骤B02得到的产物变性，得第一次捕获产物。

进一步的，在所述步骤B03之后还可包括以下步骤：

B04.利用在步骤B01中得到的固定在固相载体上的捕获探针与步骤B03所得的第一次捕获产物杂交得第二次杂交产物，分离纯化第二次杂交产物得含固相载体的第二产物；

B05.使步骤B04得到的产物变性，得第二次捕获产物。

上述任一方案中，所述步骤B中的杂交是在周期性震动中进行的。

上述任一方案中，所述含待捕获核酸片段的核酸分子为克隆载体库。

其中，所述步骤A可有多种实现方式。

在一种实施方案中，所述步骤A可包括以下步骤：

A01.使用限制性酶将克隆载体库中的待捕获核酸片段酶切下来，从而获得DNA模板；

A02.片段化DNA模板，得DNA模板片段化产物；

A03.DNA模板片段化产物与生物素标记的接头元件连接，得生物素标记的捕获探针。

在另一种实施方案中，所述步骤A可包括以下步骤：

A11.使用限制性酶将克隆载体库中的待捕获核酸片段酶切下来，从而获得DNA模板；

A12.片段化DNA模板，得DNA模板片段化产物；

A13.DNA模板片段化产物与接头元件连接，得含接头的DNA模板片段；

A14.利用生物素标记的扩增引物对步骤A13的产物进行PCR扩增，得生物素标记的捕获探针。

在另一种实施方案中，所述步骤A包括以下步骤：

A21.片段化含待捕获核酸片段的核酸分子，得片段化产物；

A22.片段化产物与接头元件连接，得含接头的核酸片段；

A23.利用生物素标记的扩增引物对步骤A22的产物进行PCR扩增，得生物素标记的捕获探针。