[发明专利]一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法有效
申请号: | 201210288003.0 | 申请日: | 2012-08-14 |
公开(公告)号: | CN103589745A | 公开(公告)日: | 2014-02-19 |
发明(设计)人: | 田凤鸣;陈剑清;舒特俊;张耀洲 | 申请(专利权)人: | 天津耀宇生物技术有限公司 |
主分类号: | C12N15/65 | 分类号: | C12N15/65;C12N15/66;C12N15/63;C12N15/09 |
代理公司: | 北京汇泽知识产权代理有限公司 11228 | 代理人: | 张瑾 |
地址: | 300457 天津市滨海新区开发区洞庭路*** | 国省代码: | 天津;12 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 靶向 家蚕 核型 多角体 病毒 复制 必需 基因 方法 | ||
1.一种带有标记基因的转移载体的制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(a)用重叠PCR的方法制备三联体基因:IE1-EGFP-SV40polyA;
(b)将步骤(a)所得的IE1-EGFP-SV40polyA克隆至载体pUC19中,获得所述转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:
(c)转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA转化DH5α大肠杆菌感受态细胞;
(d)在含氨苄青霉素的固体培养基上进行蓝白斑筛选,挑取含有转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA的白色菌落;
(e)转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA进行PCR和双酶切鉴定,并测序。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(a)具体包括:
1)用PCR的方法依次获得基因:IE、EGFP、SV40polyA;
2)采用重叠PCR方法依次拼接IE1、EGFP, 以IE1-EGFP的连接产物作为亚基因与基因SV40polyA进行拼接,获得三联体基因IE1-EGFP-SV40polyA。
4.一种带有标记基因的转移载体,其特征在于,所述转移载体通过权利要求1-3任一所述的方法制得。
5.一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1) 制备家蚕核型多角体病毒BmNPV复制非必需片段两端的同源序列:lef7、gp64;
(2)将步骤(1)所得的同源序列lef7、gp64依次克隆至权利要求2所述的转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA中,获得重组转移载体 pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64,并与家蚕核型多角体病毒基因组共转染BmN细胞,经同源重组获得带有EGFP标记的重组病毒RBmNPV-EGFP;
(3)提取重组病毒RBmNPV-EGFP的基因组与无标记基因的转移载体pUC19-lef7-gp64共转染BmN细胞;
(4)筛选无标记基因的重组病毒RBmNPV。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)具体包括:
1)抽提家蚕核型多角体病毒BmNPV基因组;
2)PCR方法获得复制非必需片段两端的同源序列LEF7、gp64。
7.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中重组转移载体 pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64与家蚕核型多角体病毒基因组通过脂质体介导转染法共转染BmN细胞。
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