[发明专利]一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法有效

专利信息
申请号: 201210288003.0 申请日: 2012-08-14
公开(公告)号: CN103589745A 公开(公告)日: 2014-02-19
发明(设计)人: 田凤鸣;陈剑清;舒特俊;张耀洲 申请(专利权)人: 天津耀宇生物技术有限公司
主分类号: C12N15/65 分类号: C12N15/65;C12N15/66;C12N15/63;C12N15/09
代理公司: 北京汇泽知识产权代理有限公司 11228 代理人: 张瑾
地址: 300457 天津市滨海新区开发区洞庭路*** 国省代码: 天津;12
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摘要:
搜索关键词: 一种 靶向 家蚕 核型 多角体 病毒 复制 必需 基因 方法
【权利要求书】:

1.一种带有标记基因的转移载体的制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:

(a)用重叠PCR的方法制备三联体基因:IE1-EGFP-SV40polyA;

(b)将步骤(a)所得的IE1-EGFP-SV40polyA克隆至载体pUC19中,获得所述转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:

(c)转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA转化DH5α大肠杆菌感受态细胞;

(d)在含氨苄青霉素的固体培养基上进行蓝白斑筛选,挑取含有转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA的白色菌落;

(e)转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA进行PCR和双酶切鉴定,并测序。

3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(a)具体包括:

1)用PCR的方法依次获得基因:IE、EGFP、SV40polyA;

2)采用重叠PCR方法依次拼接IE1、EGFP, 以IE1-EGFP的连接产物作为亚基因与基因SV40polyA进行拼接,获得三联体基因IE1-EGFP-SV40polyA。

4.一种带有标记基因的转移载体,其特征在于,所述转移载体通过权利要求1-3任一所述的方法制得。

5.一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:

(1) 制备家蚕核型多角体病毒BmNPV复制非必需片段两端的同源序列:lef7、gp64;

(2)将步骤(1)所得的同源序列lef7、gp64依次克隆至权利要求2所述的转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA中,获得重组转移载体 pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64,并与家蚕核型多角体病毒基因组共转染BmN细胞,经同源重组获得带有EGFP标记的重组病毒RBmNPV-EGFP; 

(3)提取重组病毒RBmNPV-EGFP的基因组与无标记基因的转移载体pUC19-lef7-gp64共转染BmN细胞;

(4)筛选无标记基因的重组病毒RBmNPV。

6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)具体包括:

1)抽提家蚕核型多角体病毒BmNPV基因组;

2)PCR方法获得复制非必需片段两端的同源序列LEF7、gp64。

7.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中重组转移载体 pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64与家蚕核型多角体病毒基因组通过脂质体介导转染法共转染BmN细胞。

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