[发明专利]一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA重组技术和基因打靶技术领域，特别涉及一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法。

背景技术

基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。也是研究基因功能的重要手段。现在基因敲除技术被广泛的应用于病毒基因组功能的研究中。所以一般设计一种替换型载体与病毒基因组共转染细胞来缺失基因。但是病毒基因组上留有标记基因的问题，还未进行全面的改善，这给病毒本身的功能带来了巨大的影响以及后续的病毒筛选也带来了很大的麻烦，因此我们采用两次同源重组的方法既缺失了靶基因又解决了病毒基因组上带有标记基因的难题，这为以后的科学实验有着重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种可敲除家蚕核型多角体病毒BmNPV复制非必需基因的带有标记基因的转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA及其制备方法。

为达到上述目的，本发明提供一种带有标记基因的转移载体的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)用PCR的方法依次获得基因：IE、EGFP、SV40polyA；

2)采用重叠PCR方法依次拼接IE1、EGFP, 以IE1-EGFP的连接产物作为亚基因与基因SV40polyA进行拼接，获得三联体基因IE1-EGFP-SV40polyA；

3)将步骤2)所得的三联体基因IE1-EGFP-SV40polyA克隆至载体pUC19中，获得转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA；

4)转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA转化DH5α大肠杆菌感受态细胞；

5)蓝白斑筛选(含氨苄青霉素 Ampicillin 的固体培养基)，挑取含有转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA的白色菌落。

6)转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA进行PCR和双酶切鉴定并送华大基因测序。

本发明进一步提供一种带有标记基因的转移载体，通过上述的方法制得。

本发明目的之二在于提供一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法，以解决重组病毒基因组上含有标记基因的难题，且此标记基因可被重复利用。

为达到上述目的，本发明还提供一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法，所述方法包括以下步骤：

1)抽提家蚕核型多角体病毒BmNPV基因组；

2)PCR方法获得复制非必需片段两端的同源序列LEF7、gp64；

3)将步骤2)所得的同源序列lef7、gp64克隆至上述的转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA中，获得重组转移载体pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64，并与家蚕核型多角体病毒基因组共转染BmN细胞，经同源重组获得带有EGFP标记(荧光蛋白标记基因)的重组病毒RBmNPV-EGFP，对该重组病毒RBmNPV-EGFP进行鉴定并扩大培养；

4)提取重组病毒RBmNPV-EGFP的基因组与无标记基因的转移载体pUC19-lef7-gp64(通过脂质体介导转染法)共转染BmN细胞；

5)筛选无标记基因的重组病毒RBmNPV，扩大培养用于后续实验。

本发明的有益效果：一是利用本发明构建的转移载体可以连续敲除BmNPV基因组中不同转录时相的复制非必需基因，无需构建太多的载体；二是选用绿色荧光蛋白(EGFP)作为标记基因，可以快速、直观地获得重组病毒；三是经两次同源重组解决了重组病毒基因组中含有标记基因的问题，且此标记基因可以重复使用，无需更换标记基因。

附图说明

图1 为IE1 、EGFP、SV40polyA三个基因的电泳图； M：10kb DNA标记；1：IE1的PCR产物； 2：EGFP的PCR产物；3：SV40polyA的PCR产物；

图2 为 IE1与EGFP的重叠PCR 的电泳图；M：10kb DNA标记； 1: IE1-EGFP的PCR产物；