[发明专利]一种应用多重PCR阵列技术的核酸检测方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种核酸检测方法，特别涉及应用多重PCR阵列技术检测核酸的方法，属于生物技术领域。 

二、背景技术

多重PCR技术(multiplex PCR，mPCR)是自上世纪80年代PCR技术诞生以来，该技术领域的又一大革新。传统PCR技术仅使用一对引物，通过扩增产生一个核酸片段，多用于单一目的序列的鉴定。而mPCR是在同一PCR反应体系里应用两对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与经典的PCR相同。 

mPCR最大的特点就是提高了检测的效率，使PCR成为了一种高通量的手段：(1)高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种待测靶物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一个样本就可检测多种靶标；(2)系统性，mPCR很适宜于成组靶标，如肝炎病毒、肠道致病性细菌、性病、食品微生物及细菌战剂等类别中不同病原体的同时检测；(3)经济性，多种靶标在同一反应体系内同时检出，则在时间、试剂、费用开支等方面的耗费都是很大的节省。 

mPCR技术在生物医学领域应用广泛。比如多种病原微生物的同时检测或鉴定，某些遗传病及癌基因的分型鉴定等。针对待检对象的多型别，或多位点基因突变等问题，mPCR可提高其检出率。在具体应用中，为了提高检测的特异性，引物的设计与选择则显得尤为重要。同时针对多个基因靶序列进行PCR检测，往往出现为了保证引物的特异性，而使得多对长短不一，GC含量有明显差异的引物间Tm值难以统一的现象，给整个mPCR体系的退火温度程序设置带来困难，从而减低了mPCR检测的灵敏度。本发明针对这一问题，通过mPCR技术结合通用标签序列(universal tag，UT)的方法，即在每条原有检测引物的5’端加上一个自行设计的、Tm值统一的UT引物，使得多对引物在扩增中实现退火温度的统一，提高反应的效率。与此同时，该发明还可实现多物种混合样本、多个mPCR体系的同时实施，即mPCR阵列。总而言之，对于普通mPCR而言，本发明的主要特点是使得mPCR中多重引物的不同退火温度得以统一，促进了反应的进行，提高检测灵敏度。此外，由于反应体系中UT的Tm值相对普通检测 引物偏高，使得PCR的特异性也有所提高。 

三、发明内容

本发明的目的在于提供一种核酸检测方法，通过mPCR结合UT的方法，以提高核酸检测的灵敏度和特异性。 

本发明的技术方案：一种应用mPCR阵列技术的核酸检测方法 

本发明的一个目的是提供通用标签(UT)序列，其由20-24个碱基组成，其特征在于：①上下游引物的UT序列不同、Tm值相差不超过±1℃，且大于检测引物Tm值5-10℃左右；②UT序列为随机设计的DNA片段，与待检测生物的核酸序列间无同源性。 

优选，所述UT序列由多组四个碱基组成的随机四聚体，该四聚体应满足：(1)四聚体间至少要有两个碱基是互不相同的；(2)四聚体之间不能彼此互补；(3)四聚体不应自身配对；(4)四聚体不能由两个重复碱基对组成。更优选，所述UT序列，其由6组随机四聚体组成。进一步优选，所述UT序列由以下6组随机四聚体组成：CAGC、GGTA、GACC、ACCT、ATCG、TGCG。进一步优选，UT序列具体是： 

F：CAGCGGTAGACCACCTATCGTGCG； 

R：CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGAC；和/或 

F：GGTAACCTTGCGCAGCATCGGACC； 

R：AGCCTTGAGGACCTGTAGCCGGAC；和/或 

F：TGCGCAGCATCGACCTGGTAGACC； 

R：GGACCTGTAGCCTTGAAGCCGGAC。 

本发明的另一个目的是提供一种引物对，含有上述UT序列以及检测引物对，其中UT序列加在每条检测引物的5’端。 

优选，引物对是： 

F：CAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGCCTGAATCTTCTGGTAAAAC； 

R：CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACGTTTCTGGGCTGCCAAACATTAC； 

和/或 

F：CAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGCATTATCACGGTAATTAGTG； 

R：CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACAGAGCACTGTGCACTTAAG；和/或