[发明专利]一种快速高效的均一化全长cDNA文库构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速高效的均一化全长cDNA文库构建方法，属于现代分子生物学技术领域。 

背景技术

全长cDNA文库不仅能大大提高基因测序和生物信息学分析的进程，还利于后期蛋白质表达及功能分析，也是高效、大规模获得基因序列信息的一条有效途径，尤其是对基因组庞大，近期内尚不能进行全基因组测序的生物来说更是进行功能基因组研究的一条重要途径。即使在模式生物，如拟南芥、水稻、秀丽线虫等全基因组测序完成后，分子生物学家们仍旧构建了相应生物的全长cDNA文库，并进行了大规模的全长cDNA测序，以深入了解基因的功能。如：拟南芥(A.thaliana)，小鼠(M.musculus)，果蝇(D.melanoga ster)，水稻(O.sati2va)等等，产生了大量有价值的数据，由此科学家们也取得了很多全新的研究成果，极大地促进了功能基因组学研究，推动了医学、农业和环保生物技术产品的开发。 

构建高质量全长cDNA文库是一个技术难度大、成本高、耗时长的重要生物技术。首先，获取完整的mRNA比较困难；其次，全长cDNA也不易得到；第三，有效区分全长和截短的基因非常棘手；第四，由于基因序列长短不同，克隆生长快慢也不一致，很容易导致小片段基因的富集。而基于普通cDNA文库中的基因片段来获取全长基因的方法(如RACE技术)在整个基因组范围内大规模、高通量地发 掘新基因是难以想象的。 

此外，要想获得高质量有价值的全长cDNA文库，mRNA的均一化处理非常关键。全长cDNA文库在一定程度上解决了大规模获得全长cDNA的问题，但如果想通过大规模测序来发掘新基因，还有一个无法回避的现实问题就是：冗余序列。为了提高发掘稀有表达新基因的效率，还需要对全长cDNA文库进行差减/均一化。目前有基于DNA复性动力学原理或基因组饱和杂交的方法进行cDNA文库的均一化处理方法。前者利用DSN(duplex-specific nuclease)特异降解mRNA/DNA双链中的DNA，后者将具有互补性的基因组DNA固定在磁珠上，与文库质粒进行杂交，收集流出组分。 

目前，在全长cDNA文库构建方面已经取得了很大的进展，全长cDNA文库的构建方法也不断涌现，其中主要有：CAPture法1、Oligo-capping法2、SMART3法、以及Cap-jumping法4等。 

1.CAPture法 

CAPture法(mRNA Cap Retention Procedure)利用真核生物mRNA的帽子结构和帽子结合蛋白(转录起始因子eIF-4e)相互作用的动力学原理来捕获全长cDNA。首先，在反转录酶的作用下将mRNA转录为cDNA，形成cDNA/mRNA双链复合体；接着，用RNaseA对cDNA/mRNA双链分子进行酶切。如果反转录不彻底，cDNA没有延伸到mRNA的帽子结构部位，那么靠近mRNA5＇端的mRNA将以单链形式存在，这种情况下，RNaseA就能将这类mRNA的帽子结构切除掉，因此这类cDNA/mRNA双链复合体也就不再携带帽子结构。 

CAPture法采用RNAseA酶切cDNA/mRNA复合体，以除去短截的(没有完全转录)复合体中mRNA5＇端的帽子结构。但RNaseA具有碱基偏爱性，它能够有效切割富含嘧啶的单链RNA，而对嘌呤含量较高的mRNA消化效率却很低，甚至不能切割。一般来说，mRNA的5＇端G+C含量普遍较高，尤其在5＇端非编码区，这种现象更为明显，也正是由于这种原因，致使短截cDNA掺入到全长cDNA中，导致全长cDNA在文库中的比例下降，文库中全长cDNA的比例不是很高(60％～70％)。 

2.Oligo-capping法 

Oligo-capping法(Oligo-capping)利用细菌碱性磷酸酶(Bacterial alkaline phosphatase BAP)水解5＇端不完整的mRNA的5＇磷酸团，防止短截的mRNA在后续反应中与寡聚核糖核酸连接；接着，用烟草酸焦磷酸酶(Tobacco acid pyrophosphatase TAP)除去mRNA5＇端的帽子结构，使mRNA5＇端帽子结构处的磷酸基团暴露出来；然后，用T4RNA连接酶mRNA的5＇端连上一段寡聚核糖核酸，作为引发第二链cDNA合成的引物结合位点，最后经反转录，PCR扩增、酶切、连接，建成目的文库。