[发明专利]一种广谱抗菌肽的制备方法

权利要求书

1.一种广谱抗菌肽的制备方法，其具体步骤包括：

(1)桥石短芽孢杆菌X23菌株的发酵培养:将-80℃保存的桥石短芽孢杆菌X23菌种接种于装有NB液体培养基的三角瓶中，28℃、200 rpm过夜培养至对数生长期，即为发酵培养的种子液，将该种子液以体积比10%接种于新鲜的NB液体培养基，28℃、200 rpm培养32h，得到X23的发酵菌液；

(2) 无菌发酵液的制备：X23发酵菌液经7,600 rpm离心，取上清液经孔径为0.22 μm的过滤器(Millipore公司，Cat. No. GPWP04700)过滤，得到无菌发酵液；

(3) X23外泌非核糖体抗菌肽粗制备液的制备：取步骤(2)制备的无菌发酵液，冷冻真空干燥浓缩50倍后用氯仿抽提，11000 rpm离心10 min后收集上层水相，经80℃水浴10min后11000rpm离心10min，水相即为X23外泌非核糖体抗菌肽粗制备液；

(4) 固相萃取分离：固相萃取法(SPE)富集非核糖体抗菌肽tyrocidine T 选用华谱新创科技有限公司EMERALD产品，柱活化后将非核糖体抗菌肽粗制备液过柱，依次采用不同溶液进行洗脱，去除非活性组分，富集非核糖体抗菌肽；

(5)色谱分离：X23外泌非核糖体抗菌肽tyrocidine T的高效液相色谱分析(HPLC) 洗脱液经冷冻真空干燥后用ddH₂O溶解，反相色谱分析发现活性组分具有较强的极性，在反相色谱柱(Bio-C18，150×4.6 mm, i.d. 5 μm)上保留较弱；基于此，随后采用亲水色谱法(HILIC)对该组分分别进行分析(Bio-Amide, 150×4.6 mm, i.d. 5 μm)和制备(Bio-Amide, 150×10 mm, i.d. 5 μm)，流动相为A0.1%TFA乙腈，B0.1%TFA溶液，梯度洗脱(0-60 min，5-50% A)，检测波长为254 nm；

 (6)非核糖体抗菌肽tyrocidine T的鉴定：选取有明显的抑菌活性的样品组分进行MALDI-TOF-TOF和MS/MS串联质谱鉴定，结果显示，tyrocidine T的分子量为1270.73，其一级结构为_DPhe-Pro-Tyr-_DPhe-Asn-Gln-Tyr-Val-Orn-Leu。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中依次采用不同溶液进行洗脱是指先用3柱体积5%甲醇水溶液冲洗、2柱体积再用100%甲醇溶液冲洗、最后用4柱体积1%甲酸-99%甲醇溶液进行洗脱。