[发明专利]一种广谱抗菌肽的制备方法

说明书

一、技术领域

本发明为一种桥石短芽孢杆菌X23外泌新型非核糖体抗菌肽Tyrocidine T及其发酵制备，属于微生物发酵和生物分离领域，本发明涉及新型非核糖体抗菌肽Tyrocidine T的微生物发酵、分离鉴定及其在农业生产中的应用。

二、技术背景

桥石短芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一个种，菌体呈短杆状，细胞壁厚，广泛分布于自然界。公开号为CN    的中国专利公开了一种桥石短芽孢杆菌X23及其应用，该菌对茄科作物青枯病菌的抑制能力强。除此之外，还对多种病原真菌和病原细菌具有拮抗作用。本发明通过大量的实验证明桥石短芽孢杆菌X23菌株能够有效地抑制茄科作物青枯病菌的生长；此外，对烟草黑胫病菌、水稻稻瘟病菌、烟草赤星病菌和马铃薯晚疫病菌也具有明显的拮抗作用。该菌在生长过程中可以向外界分泌种类丰富、数量可观的蛋白质和NRPs等次生代谢产物。

NRPs由非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetases, NRPSs)催化合成。NRPSs是由多个酶按模块化(module)组成的大的复合体，每个酶含一个或多个模块，每个模块激活一个特定的氨基酸并将其整合到新生的肽链中。典型的模块由腺苷酰化结构域(A结构域)、巯基化结构域(T结构域)和缩合结构域(C结构域)等三个核心结构域组成，模块的数量、排列顺序和方向与其产物的氨基酸数量、排列顺序和方向之间存在严格的共线性关系，如短杆菌酪肽(tyrocidine)等。此后还发现了另外2种合成NRPs的方式：iterative NRPSs和nonlinear NRPSs。Iterative NRPSs是指同一个模块或结构域在肽链合成过程中不止一次地往新生肽链上重复激活和添加某个氨基酸，导致肽链由多个小的重复序列组成；Nonlinear NRPSs方式合成的肽链顺序与其合成酶的模块之间并不存在严格的共线性关系。在NRPSs的最后一个模块的C-末端通常有起终止延伸和释放产物功能的硫酯(thioesterase, TE)结构域。除了上述核心结构域，在同一个模块内可能还存在一些附加的结构域，如差向异构结构域(E结构域)和甲基化结构域(M结构域)等，它们在肽链合成过程中对氨基酸底物进行修饰；乙酰化、糖基化和脂质化等结构域则对肽链骨架进行修饰。如果不具有这些结构域，修饰作用则由独立于NRPSs的酶催化完成。

NRPs在医药、农业和生物学等领域具有极大的研究价值和应用潜力，除了可以杀死或抑制病原菌，NRPs还被广泛用于抗肿瘤和抑制免疫反应等。目前临床应用最多的10种抗生素类产品中有8种为NRPs，在抗感染和抗肿瘤等领域的市场份额分别达到了68.3%和79.8%。NRPs也可以抑制或杀死作物病原微生物，在农业领域也具有良好的应用潜力。因此，新的NRPs的分离与鉴定是当前天然产物研究的热点领域之一。

三、发明内容

本发明涉及非核糖体抗菌肽tyrocidine T的分离纯化和鉴定的方法及其用途。

本发明采用的微生物菌种，桥石短芽孢杆菌X23(Brevibacillus choshinensis X23)来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为：CGMCC NO：4534。

桥石短芽孢杆菌X23是一种能分泌对多种病原微生物具有抑制杀伤作用的非核糖体抗菌肽的根际微生物。这些非核糖体抗菌肽具有热稳定性高、耐受蛋白酶水解的能力强和不易诱导靶标微生物产生选择性抗性等特点。由于此类抗菌肽通常以多种结构类似物的形式共同存在于其发酵液中，并且有环状结构和非编码氨基酸，可以耐受高温、蛋白酶和有机溶剂处理等严苛条件而不影响其结构稳定性及生物学活性。

根据上述特点，优选本发明的分离、纯化及鉴定方法为：

(1)桥石短芽孢杆菌X23菌株的发酵培养

将-80℃保存的桥石短芽孢杆菌X23菌种接种于装有NB液体培养基的三角瓶中，28℃、200 rpm过夜培养至对数生长期，即为发酵培养的种子液，将该种子液以体积比10%接种于新鲜的NB液体培养基，28℃、200 rpm培养32h，得到X23的发酵液。

(2) 无菌发酵液的制备

X23发酵液经7,600 rpm离心，取上清液经孔径为0.22 μm的过滤器(Millipore公司，Cat. No. GPWP04700)过滤，得到无菌发酵液。

(3) X23外泌非核糖体抗菌肽粗制备液的制备