[发明专利]采用芥菜型油菜基因ANS和埃塞俄比亚芥BAN共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种基因工程和微生物发酵技术领域的方法，特别是一种采用双关键酶基因共转化和在培养基中添加关键酶基因催化反应前体物的粗提物来提高大肠杆菌合成原花色素的方法。

背景技术

原花色素(Proathocyanidins)，也叫原花青素，是类黄酮的一种。原花色素是清除自由基最强的抗氧化剂之一，能保护大脑与神经组织，改善血液循环，灵活关节和年轻皮肤的作用。长期食用高含原花色素的食品，可以缓解心血管等疾病。科学家还发现原花色素及其衍生物还具有抗炎、抗逆境、抗肿瘤以及免疫调节的功能，可见原花色素素是一种极具潜力的天然药物，消费需求越来越大。

目前原花色素的主要来源是从植物组织部分提取，但植物生长需要较长的时间，原花色素的含量不高且提取工艺比较复杂，产率低，使得原花色素的大规模商业化生产受到了限制。由于原花色素人工合成难度较大，产量低，成本高，可行性不强。

我们在前期的研究中发现芥菜型油菜基因ANS（anthocyanidin synthase，花色素合成酶）和埃塞俄比亚BAN（anthocyanidin reductase 花色素还原酶）的表达量与种皮原花色素的含量呈正相关。经对现有技术文献检索发现YanY J等（2008）在《生物工程与生物技术》（Biotechnol. Bioeng. 2008;100: 126–140）上报道了利用在大肠杆菌中表达拟南芥、非洲菊（Gerbera）, 矮牵牛（Petunia）、金鱼草（Antirrhinum）中的花色素（Anthocyanin）合成途径中的基因可以提高大肠杆菌花色素的合成量，花色素和原花色素都属于类黄酮类物质，但未见有采用芸薹属物种原花色素合成基因来提高大肠杆菌原花色素的合成量的报道。

花色素合成酶ANS和花色素还原酶BAN是原花色素合成途径中的二个关键酶，研究表明，花色素合成酶和花色素还原酶的活性越高，越有利于合成原花色素，采用基因工程手段，用关键酶基因ANS和BAN 共转化大肠杆菌，加强它们在大肠杆菌中的表达，将打破原花色素生物合成限速瓶颈，从而获得原花色素高产的菌株，为规模化生产原花色素提供一条新途径。

 发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种采用基因ANS和BAN 共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法。本发明涉及的关键酶基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、原花色素提取及含量测定。本发明建立了提高大肠杆菌中产原花色素的方法，为利用转基因大肠杆菌大规模生产原花色素奠定坚实的基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种采用芥菜型油菜基因ANS 和埃塞俄比亚芥BAN 共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法，包括以下步骤：

（1）从芥菜型油菜种子的cDNA中克隆花色素合成酶ANS基因和埃塞俄比亚芥种子的 cDNA中克隆花色素还原酶BAN基因；

（2）把ANS 和BAN 基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含ANS 和BAN基因的原核表达载体；

（3）将ANS和BAN基因同时导入BL21大肠杆菌，转化的单菌落在0.5-1.0 mL的LB液体培养基中，28-38℃，150-250rpm(转/分钟)培养6-12小时候后，再在含黑色葡萄皮提取物的LB液体培养基中，28-38℃，150-250rpm震荡培养36-54小时后，常温下，10000-12000g离心10-20min收集菌体；

（4）采用DMACA-HCl法测定大肠杆菌所含原花色素的量，筛选获得原花色素含量提高的大肠杆菌菌株。

所述的LB液体培养基中含0.2-0.8g/L的黑色葡萄皮提取物。

所述的黑色葡萄皮提取物提取方法是：将黑色或深红色的葡萄皮用粉碎机粉碎，过1.0 mm 的筛，将用20％-50％的甲醇(v/v)作为萃取溶剂，葡萄皮量与溶剂用量之比为1∶3-5(w/w)，萃取温度为50℃-60℃，萃取时间为3-6h。回收甲醇后的浓缩液在10000-12000g离心10-15min，过滤去渣，然后在浓缩液中加入丙酮，浓缩液与丙酮之比为1∶1-2(v/v)，搅拌混匀5-10min，，过滤除去杂质，浓缩液经回收丙酮后，在40℃-60℃下真空干燥即得葡萄皮提取物。