[发明专利]钙网蛋白-可溶性程序性死亡受体1的融合蛋白及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及DNA重组技术和蛋白质药物领域，属于医药生物技术领域，具体涉及钙网蛋白-程序性死亡受体1融合蛋白，编码该融合蛋白的DNA序列，含有该DNA序列的载体或质粒、宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白的方法，以及该融合蛋白在肿瘤等疾病中的应用。

背景技术

钙网蛋白(calreticulin，CRT)是一种高度保守的钙结合蛋白，属于热休克蛋白家族，主要存在于内质网，具有多种生物学功能。CRT介导的免疫原性细胞凋亡(immunogenic apoptosis)在抗肿瘤免疫中具有重要意义。有研究发现某些抗肿瘤治疗能诱导细胞的CRT从胞内向膜表面快速转位并在细胞膜上簇集，出现在凋亡细胞膜上的CRT可被DC细胞识别和吞噬。Obeid研究小组应用双向电泳筛选并鉴定了一系列具有使CRT膜簇集的诱导剂，如蒽环类药物（anthracyclines），奥沙利铂（oxaliplatin），紫外线和γ-射线。这些诱导剂在诱导肿瘤细胞发生凋亡的同时，还使CRT从细胞内质网转移到细胞膜并呈簇集分布。这类凋亡的肿瘤细胞具有良好的免疫原性，应用这类凋亡的小鼠肿瘤细胞接种小鼠能诱导出强大的抗肿瘤免疫活性。多数抗肿瘤药物能诱导肿瘤细胞凋亡但不能使CRT发生膜转位和簇集，这类凋亡的肿瘤细胞也不具备肿瘤免疫原性。但将这类凋亡细胞包被重组的CRT蛋白，则可获得同样的抗肿瘤免疫效应，这些结果表明CRT分子的膜簇集是凋亡细胞具有免疫原性的关键因素。研究发现，凋亡的肿瘤细胞膜表面簇集的CRT能作为“吞噬我(eat-me)”信号传递给DC，促使DC细胞活化并吞噬肿瘤细胞，DC在成熟的过程中加工并提呈肿瘤特异性抗原，从而诱导特异性CD4+和CD8+T细胞活化和增殖，由此产生对同种肿瘤的免疫杀伤活性。

程序性死亡受体1(programmed cell death 1，PD-1)及其配体PD-L1（programmed cell death 1 ligand 1）是B7-CD28家族的免疫共刺激分子，产生负向免疫调节作用，在机体的免疫稳定方面具有重要的生理功能。PD-1主要表达于活化的淋巴细胞膜表面，PD-L1与PD-1结合后诱导淋巴细胞的无能甚至凋亡，防止免疫反应的过度活化。但在肿瘤免疫研究中发现肿瘤细胞表面PDL1的高表达，它与肿瘤组织内淋巴细胞上的PD-1结合后，将抑制效应性T细胞活性，同时降低后者IL-2和IFN-γ的表达和分泌，形成肿瘤细胞免疫逃逸的微环境，促进肿瘤的生长。阻断PD-1/PD-L1相互结合的方法可用于肿瘤的免疫治疗。有学者应用PD-1胞外区（sPD-1）的原核表达蛋白或者sPD-1的真核表达质粒处理荷瘤鼠，结果发现sPD-1蛋白不仅抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长，增强肿瘤特异性CTL细胞的功能。应用PD-L1抗体阻断PD-1/PD-L1途径后，也能促进CD8+T细胞增殖和细胞因子的分泌，诱导肿瘤的消退。应用人源化的PD-1单克隆抗体进行肿瘤治疗已进入临床Ⅱ期，并取得良好的抗肿瘤效果。这些结果提示阻断PD-1/PD-L1信号通路能达到有效的治疗肿瘤的目的。

肿瘤的免疫逃逸是肿瘤得以发生、发展的关键因素，其中肿瘤诱导大量的免疫抑制分子构成的信号通路抑制了机体免疫系统对肿瘤组织的杀伤效应。鉴于sPD-1具有阻断PD-1/PD-L1、促进机体对肿瘤的免疫杀伤、及将CRT蛋白特异性包被在肿瘤细胞表面具有促进肿瘤特异性抗原提呈作用；因而本发明制备了小鼠钙网蛋白C区部分截短(Calreticulin，CRT_⊿)与可溶性程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PD1）胞外段(sPD1)的融合蛋白CRT_⊿-sPD1，并在小鼠黑色素瘤细胞B16-F1中分泌表达，使sPD-1与肿瘤细胞表面的PDL1结合，阻断PD1/PDL1信号通路，同时使CRT被包被在肿瘤细胞膜表面，使融合蛋白CRT_⊿-sPD1同时获得两方面的抗肿瘤免疫作用，达到有效抗肿瘤的免疫调节功能。

发明内容

本发明的目的是提供一种钙网蛋白-可溶性程序性死亡受体1的融合蛋白及其制备方法和用途。本发明所制备的CRT_⊿-sPD1融合蛋白具有结合细胞表面PD-L1及促进淋巴细胞增殖和杀伤的活性；还能够在体内活化、诱导免疫系统对肿瘤进行特异性的杀伤，抑制肿瘤生长、延长肿瘤鼠的生存期，可作为肿瘤免疫治疗候选药物，用于治疗肿瘤等疾病。