[发明专利]一种柑橘溃疡病菌拮抗细菌抑菌能力的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及拮抗细菌对植物病原细菌抑菌能力的测定方法，具体涉及对柑橘溃疡病菌抑菌能力的测定方法。

背景技术

柑橘溃疡病是由地毯草黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv. citri)引起的一种国内外检疫性细菌病害，主要侵染芸香科柑橘属、枳属及金柑属植物，引起柑橘叶片、果实、枝干溃疡斑，导致树势生长衰弱，产量和品质下降，造成巨大的经济损失。

该病害可通过气孔、皮孔等自然孔口或外界造成的伤口侵入寄主；通过风雨、媒介昆虫、农事操作等局部传播，带菌的种苗、接穗和果实等柑橘材料远距离传播。目前对柑橘溃疡病的防治措施主要采用以农业防治为基础，化学药剂为主的防治技术，柑橘是世界上重要的商品水果，环境污染、病原菌抗药性以及果品农药残留等问题限制了化学农药的大规模利用。为提高我国柑橘的品质和出口标准，探索该病害新的防治途径以克服农药残留和病原菌抗药性等问题也势在必行。生物防治对环境友好，无污染，不易在果实上残留，因而备受人们的关注。因此筛选获得有抑菌能力的拮抗微生物成了研究柑橘溃疡病生物防治的重要前期基础。

目前柑橘溃疡病的拮抗微生物的筛选方法中，关于测定拮抗菌株抑菌能力的方法有抑菌圈法、牛津杯法、平板对峙法等，其直接以拮抗菌株的菌悬液来进行测定，在测定过程中，拮抗菌株继续在培养基上生长，由于不同的菌株生物学特性不同，生长和产生代谢产物的能力也不同，导致测定的抑菌圈大小不准确，因此难以同时比较不同菌株的抑菌能力。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一种柑橘溃疡病菌拮抗细菌抑菌能力的测定方法——无菌滤液纸碟法，此法不仅能用于测定出分离获得的拮抗细菌对柑橘溃疡病菌的抑制能力，还可以为筛选柑橘溃疡病有潜在应用价值的拮抗细菌提供操作简便、试验稳定性好的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是按以下步骤进行：

(a) 将1.0 × 10⁶ CFU/ mL的拮抗细菌新鲜菌液1 mL接种到盛有50 mL 的NB液体培养基的三角瓶中，28℃下180 r/min振荡培养72 h后，经12,000 r/min离心20 min，取上清液，经孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌即得无菌滤液；

(b) 将直径10 mm的无菌滤纸片放入步骤(a)制得的无菌滤液中浸润20min；

(c) 将柑橘溃疡病菌配制为2.0 × 10⁸ CFU/ mL的菌悬液，取2 mL菌悬液与冷却至50℃的200 mL NA培养基混匀，倒入直径90mm的培养皿制平板，每个平板20 mL；

(d) 往步骤(c)制得的含柑橘溃疡病菌的平板中央放入步骤(b)制得的浸润拮抗细菌无菌滤液的滤纸片，28℃培养48 h后，观察记录拮抗细菌对柑橘溃疡病菌的抑菌能力，测定抑菌圈直径。

步骤(a)中，NB液体培养基组成为：牛肉浸膏3.0 g，酵母浸膏1.0 g，蛋白胨8.0 g，葡萄糖10.0 g，牛肉膏3.0 g，水1,000.0 mL, pH 6.8-7.0。

步骤(b)中，NA培养基组成为：牛肉浸膏3.0 g，酵母浸膏1.0 g，蛋白胨8.0 g，葡萄糖10.0 g，牛肉膏3.0 g，琼脂18.0 g，水1,000.0 mL, pH 6.8-7.0。

本发明的有益效果是：本发明使用拮抗细菌无菌滤液纸碟法能有效地测定出分离获得的拮抗细菌对柑橘溃疡病菌的抑制能力，操作简便、试验稳定性好、抑菌圈宽度测定准确。此外本法不需要特别的仪器，实验成本较低。使用本发明方法能筛选出对柑橘溃疡病有潜在应用价值的拮抗细菌。

附图说明

图1为本发明实施例中拮抗细菌抑制柑橘溃疡病菌能力结果示意图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例：使用本发明所述的方法测定分离获得的拮抗细菌对柑橘溃疡病菌的抑菌能力：

1、将分离纯化后的柑橘溃疡病菌的拮抗细菌菌株用无菌水配制为1.0 × 10⁶ CFU/ mL的新鲜菌液，取1 mL接种到盛有50 mL 的NB液体培养基的三角瓶中，28℃下180 r/min振荡培养72 h后，经12,000 r/min离心20 min，取上清液，经孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌即得无菌滤液。