[发明专利]一种鉴定水稻低植酸突变体zju-lpa2杂交后代基因型的引物及方法

说明书

技术领域

本发明属于农业生物工程技术领域，尤其涉及一种鉴定水稻低植酸突变体zju-lpa2杂交后代基因型的引物及方法。

背景技术

植酸是植物种子中磷主要的贮存形式，约占种子全磷量的65-85％左右。植酸通常与Zn²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺等金属阳离子螯合成植酸盐，并与蛋白进一步形成球状复合体，沉积在禾本科作物籽粒的糊粉层中。由于人和非反刍动物(猪、鸡、鱼等)体内不含植酸酶，难以消化利用摄入的植酸，极大降低了磷元素的生物有效性，同时植酸还影响微量元素、蛋白和淀粉的生物有效性，是一种典型的抗营养因子。此外，一方面难以被利用的植酸随动物粪便排泄到环境中，引起水体富营养化，造成严重的环境污染；另一方面为了满足动物生长发育的需要，饲料中还需额外添加有机磷或骨粉等，提高了饲养成本。许多学者提出可用植酸酶降解植酸析出有效磷供动物利用；也可将植酸酶基因转入植物，使植酸酶在种子中得到表达，从而提高饲料中植酸磷的利用率。

因此，降低作物籽粒中植酸的含量日益成为育种学家、营养学家和环境学家关注的焦点。运用理化诱变和基因工程技术，创制种子中植酸含量下降的低植酸(LPA)作物，可从源头上解决上述问题。

迄今，国内外已从水稻、大豆、玉米、大麦、小麦等作物中获得了一批LPA突变体，培育出了一些LPA作物新品种。大量的动物体内试验表明，LPA作物极大地提高了磷的生物有效性，减少了环境中的磷污染，有效改善了动物体内微量营养元素缺乏症。但目前获得LPA突变系的主要途径是理化诱变和自然筛选，并且只能收获作物成熟种子后才能通过微量测定方法检测个体种子无机磷含量，初步筛选高无机磷品系，然后根据材料表型及实验条件进一步通过铁沉淀等方法测定植酸磷和全磷含量，选育周期较长，成本高，且效率低。

随着现代分子生物学理论和技术的快速发展，利用正向(图位克隆)或反向遗传学(RNAi，T-DNA插入突变)技术，已报道克隆了若干LPA基因(MIPS，MIK，MRP，2-PGK，IPK1)，不仅揭示了LPA突变发生的分子机制，也为基于LPA相关基因核苷酸变异的引物在LPA作物新品种的选育方面奠定了理论基础。如文献(Kim，S.I.，Andaya，C.B.，Newman，J.W.，Goyal，S.S.，and Tai，T.H.2008.Isolation and characterization of a low phytic acid rice mutant reveals a mutation in the rice orthologue of maize MIK.Theoretical and Applied Genetics 117(8)：1291-1301.)公开的水稻材料N15-186中植酸含量下降则是由MIK基因的等位突变导致的(Shi，J.R.，Wang，H.Y.，Hazebroek，J.，Ertl，D.S.，and Harp，T.2005.The maize low-phytic acid 3encodes a myo-inositol kinase that plays a role in phytic acid biosynthesis in developing seeds.The Plant Journal 42(5)：708-719)，这为利用分子生物学技术选育LPA水稻新品种提供了一个新的方向。

水稻是我国及世界上最主要的粮食作物。作为稻米生产和消费的大国，我国也是铁缺乏和缺铁性贫血等微量元素缺乏症发生较严重的国家之一，而降低水稻植酸含量可显著提高Fe³⁺、Zn²⁺等微量元素的生物有效性。因此，若能获得与目的基因共分离的分子标记，有效快速鉴定含有目的基因的低植酸水稻材料，培育具有营养与环保双重功能的LPA水稻在我国就有重要的经济和社会意义。

发明内容

本发明提供了一种引物，利用该引物可以方便地在苗期对水稻低植酸突变体zju-lpa2杂交后代的基因型进行鉴定。

一种引物，为引物ZHJ1、引物ZHJ2或它们的组合；其中，引物ZHJ1的碱基序列为：

正向引物序列：5’-TCCTTTAGTCTAGGACCGTTGG-3’；

反向引物序列：5’-AGCCGCTTCTTGGAGTGAT-3’

和5’-ACCAGGGATGCCGTTGAG-3’；