[发明专利]一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法

权利要求书

1.一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于：

（1）受体及侵染液的准备

挑选拟转化植物品种的饱满、无破损、无霉变的种子，去掉残留物，有壳的去掉壳，水洗，25℃下浸泡7～10h，常规消毒，用无菌水洗净，摆放于灭过菌的含2层滤纸、直径为90mm的玻璃培养皿中，加无菌水，无菌水的加入量以保持滤纸湿润为宜，28℃暗培养发芽1～2d；所述受体为经上述处理过的种子的芽生长点；

划板挑取带有外源基因的农杆菌单菌落，接入含50mg/L卡那霉素、40mg/L利福平的LB液体培养基，28℃、220 rpm暗培养至菌液OD₆₀₀=0.5～0.6，4000rpm、5min离心收集菌体，弃上清液加入1/5～1/2所述LB液体培养基体积的侵染基液，摇匀制备成所述侵染液，即农杆菌介导转化液；所述侵染基液含100μmol/L AS、100mg/L F68、400mg/L MES、1/10 MS的盐、10g/L葡萄糖、40g/L麦芽糖，pH 5.6；

（2）芽生长点暴露与微创转化

①时机把握：对于籽粒较小的植物芽伸长到0.2～2cm时，对于籽粒较大的植物芽伸长到0.3～1cm时，实施转化处理；

所述籽粒较小的植物包括小麦、水稻、谷子、黍子和高粱，所述籽粒较大的植物包括玉米；

②暴露生长点的方法

对于地中茎不伸长的植物，直接用摄子掰去胚芽鞘和已分化出的幼叶即可；对于地中茎伸长的植物，找出地中茎与生长点结合区形成的折光带，在靠近折光带的上方用刀片切去芽鞘和已分化出的幼叶；

③用微创转基因刷转化

用微创转基因刷蘸所述农杆菌介导转化液后，对准拟转化种子的芽生长点刺刷2～3次，然后按种子芽生长点向上的方向摆放于铺有2层滤纸、灭过菌的培养皿中，所述滤纸用无菌水润湿，每个培养皿中放置10～40粒种子；

（3）共培养

往放有转化处理过的芽生长点种子的培养皿中滴加无菌水使培养皿中的滤纸保持湿润，无菌水的滴加量为0.5～3ml，盖上皿盖，置于25℃暗培养3d；

（4）苗培养

将完成共培养的材料，用蛭石覆盖根系，或转至含蛭石的钵器，25℃、光照12h/d培养直至成苗；对于不需做春化处理的作物，培养7d就移栽于温室，或完成共培养后就直接移播于温室，覆罩上塑料薄膜，7～10d后揭膜；

对于需春花处理的冬小麦，则先25℃、光照12 h/d培养7d，然后转到8℃的春化箱内春化处理20～30d，具体天数因品种而定；

（5）幼苗移栽

苗长成后，移栽于按要求隔离防护的温室或农田；

（6）苗及植株管理

采取水肥措施促进苗健壮发育，促进多结粒；对于雌雄异花的玉米及时做好雌雄穗的套袋防护和人工授粉工作；

（7）分子检测与鉴定

在T₀代不进行检测，以免结果不真实；将T₀植株所结的种子，按单株收获；将所收种子逐株萌发成苗进行检测，即在T₁代开始检测、鉴定；对于外源基因有抗性功能的，先进行抗性筛选，然后对选出的抗性苗或植株进行PCR检测；对于不具有抗性功能的，直接逐株进行PCR检测；对经PCR鉴定为阳性的材料，进行Southern blot检测予以确证。

2.根据权利要求1所述的一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于所述微创转基因刷，其刷毛由微米级的不锈钢纤维或碳硅纤维或玻璃纤维制成，刷毛单根直径为4～20μm，每刷的刷毛根数为100～5000根，刷毛露出长度为0.5～3mm。

3.根据权利要求2所述的一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于所述微创转基因刷的刷毛单根直径为8～18μm，每刷的刷毛根数为大于100根、小于等于2000根，刷毛露出长度为1～2mm。

4.根据权利要求1或2或3所述的一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于所述“刺刷”为即刺又刷；所述“刺”为用蘸过农杆菌介导转化液的微创转基因刷，瞄准芽生长点顶部直刺，送入带有外源目的基因的农杆菌；所述“刷”为用蘸过农杆菌介导转化液的微创转基因刷，对整个芽生长点像梳头一样刷划，送入带有外源目的基因的农杆菌。

5.根据权利要求4所述的一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于所述地中茎不伸长的植物包括小麦和水稻；所述地中茎伸长的植物包括玉米、谷子、黍子和高粱。