[发明专利]一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，适用于所有结种子的单子叶植物。

背景技术

在诸多植物转基因方法中，农杆菌介导法最被普遍认可。它具有获得的转基因植株育性较高、外源基因多以单拷贝或低拷贝在受体中整合、可转移大片段DNA等优点。但是，目前所有以农杆菌介导为基础的转基因技术，大都离不开组织培养，故存在着受基因型限制、操作复杂、需借助抗性标记筛选、周期长、转化效率低、转化结果不稳定等突出问题。尤其以小麦、水稻、玉米等为代表的单子叶植物的转基因，受基因型限制问题十分突出，严重影响了技术的发展与应用。

植物种子芽生长点是形成生殖器官和地上大部分营养体的原始细胞群。萌发后的单子叶植物种子芽生长点，具有很强的再生能力和发育补偿能力，去掉芽鞘和已分化的微型幼叶后，乃至受到较强的创伤后，仍能发育成正常植株，是实施转基因的理想受体。

有报道和专利虽也注意到了用种子芽生长点做受体的优势，但对生长点的特点研究不够，未形成稳定、简易、高效的技术方案和技术体系，存在较多问题，如：实施转化处理的时间较晚，导致对生长点的转化覆盖度低；对生长点不做任何创伤处理，或创伤方法不佳，造成的生物伤害过重，而转化所需要的创伤却不够，导致转化效果较差；抗性筛选策略使用不当，容易淘汰“被有效转化”了的嵌合体；当代鉴定不合理，假阳性率高，等等。

中国专利《一种改良的农杆菌介导小麦苗端转化方法》（专利号：200410075773.2），所述主要步骤包括：1）种子萌发后再4℃春化20-30d；2）含有目的基因农杆菌的活化与重悬；3）对适宜大小的幼苗进行切割，暴露或损伤生长点部位；4）将含有目的基因的农杆菌菌液滴至幼苗切口处；5）幼苗恢复生长以及移至土中培养和抗生素筛选获得转基因植株及子代；6）转基因植株及子代的鉴定。所述适宜大小的幼苗是指2-4cm长的幼苗。

上述专利的主要问题如下：

（1）春化后进行转化，转化时机过晚，减少了转化的有效覆盖度，在创伤方面为农杆菌介导转化提供的条件不充分，且生物伤害重。

（2）操作难度大、分寸不易把握、工作效率不高。

有些报道，用各种针刺伤转化对象生长点，但所用针的直径普遍较粗【African Journal for Biotechnology,2011,10(5):740-750】，有的甚至达710μm【Journal of bioscience and bioengineering, 2005，100(4): 391-397；2006，102(3):162-170】，对生长点造成的生物伤害重，而对转化所需的创伤则造成得不够。有些报道，则是用手术刀片划几下，造成的转化所需的创伤不充分，转化效果不佳；还有不少报道不做任何创伤处理，就用农杆菌进行转化，转化效果难以保障。

总之，很多以生长点为转化对象的专利或报道，仍然未离开“离体培养”环节，而且使用的抗性筛选的策略不够科学。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种不依赖组织培养、不受基因型限制、不必须抗性筛选、转化效率高、转化效果稳定、操作简易方便、实用性强、易于规模化、耗费成本低的充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法。

本发明采用如下技术方案：

一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于：

（1）受体及侵染液的准备

挑选拟转化植物品种的饱满、无破损、无霉变的种子，去掉残留物，有壳的去掉壳，水洗，25℃下浸泡7～10h，常规消毒，用无菌水洗净，摆放于灭过菌的含2层滤纸、直径为90mm的玻璃培养皿中，加无菌水，无菌水的加入量以保持滤纸湿润为宜，28℃暗培养发芽1～2d；所述受体为经上述处理过的种子的芽生长点；

划板挑取带有外源基因的农杆菌单菌落，接入含50mg/L卡那霉素、40mg/L利福平的LB液体培养基，28℃、220 rpm暗培养至菌液_OD600=0.5～0.6，4000rpm、5min离心收集菌体，弃上清液加入1/5～1/2所述LB液体培养基的侵染基液，摇匀制备成所述侵染液，即农杆菌介导转化液；所述侵染基液含100μmol/L AS、100mg/L F68、400mg/L MES、1/10 MS的盐、10g/L葡萄糖、40g/L麦芽糖，pH 5.6；

（2）芽生长点暴露与微创转化

①时机把握：对于籽粒较小的植物芽伸长到0.2～2cm时，对于籽粒较大的植物芽伸长到0.3～1cm时，实施转化处理；