[发明专利]一种应用于检测线粒体 DNA A1555G、C1494T 突变的混合液及试剂盒和检测系统

权利要求书

1.一种应用于检测线粒体DNA A1555G、C1494T突变的混合液，其特征在于所述混合液包括引物F1、R1和四条探针N1、N2、M1、M2的混合液；

第一条引物序列F1是有意义链，为上游通用引物，第二条引物序列R1是反义链，为下游通用引物；

四条探针分别为以人体线粒体DNA为模板在线粒体DNA A1555位点设计的野生型探针一条和突变型探针一条，另在线粒体DNA C1494位点处设计的野生型探针一条和突变型探针一条。

2.如权利要求1所述的一种应用于检测线粒体DNAA1555G、C1494T突变的混合液，其特征在于所述一对引物是依据已公开的人类线粒体DNA序列设计的；第一条引物序列F1是有意义链，为上游通用引物，位于线粒体DNA的核苷酸序列1445-1465bp之间，其序列为序列表中的SEQ ID NO:1；第二条引物序列R1是反义链，为下游通用引物，位于线粒体DNA的核苷酸序列1589-1608bp之间，其序列为序列表中的SEQ ID NO:2，也包括这两条引物的互补链。

3.如权利要求1或2所述的一种应用于检测线粒体DNAA1555G、C1494T突变的混合液，其特征在于四条探针之间不能存在相互干扰四条探针的四种荧光发光猝灭基团不能相互抑制或抵消，以便发出四种不同波长的荧光信号能区分两个位点的四种表现。

4.如权利要求1-3任一项所述的一种应用于检测线粒体DNA A1555G、C1494T突变的混合液，其特征在于所述四条探针是包括应用TaqMan-LNA、TaqMan-MGB、TaqMan-AllGlo技术标记设计的探针。

5.如权利要求1-4任一项所述的一种应用于检测线粒体DNA A1555G、C1494T突变的混合液，其特征在于第一条探针N1的序列，在线粒体DNA C1494T的突变型位点附近设计，是有意义链，也包括其互补链，位于线粒体DNA的核苷酸序列1484-1497bp之间，其序列为序列表中的SEQ ID NO:3；第二条探针N2的序列，在线粒体DNA 1494的野生型位点附近设计，是有意义链，也包括其互补链，位于线粒体DNA的核苷酸序列1483-1498bp之间，其序列为序列表中的SEQ ID NO:4；第三条探针M1的序列，在线粒体DNAA1555G的突变型位点附近设计，是反义链，也包括其互补链，位于线粒体DNA的核苷酸序列1548-1563bp之间，其序列为序列表中的SEQ ID NO:5；第四条探针M2的序列，在线粒体DNA 1555的野生型位点附近设计，是反义链，也包括其互补链，位于线粒体DNA的核苷酸序列1548-1562bp之间，其序列为序列表中的SEQ ID NO:6。

6.如权利要求1-5任一项所述的一种应用于检测线粒体DNA A1555G、C1494T突变的混合液，其特征在于所述四条探针采用TaqMan-LNA技术标记设计的探针,采用TaqMan-LNA技术标记设计的探针分别带有以下发光猝灭荧光基团及LNA碱基；第一条探针N1为线粒体DNA C1494T的突变型LNA探针，其5′末端标记的是CY5荧光报告基团，3′末端标记的是BHQ1荧光猝灭基团，加LNA碱基；第二条探针N2为线粒体DNA1494的野生型LNA探针，其5′末端标记的是ROX荧光报告基团，3′末端标记的是BHQ1荧光猝灭基团，加LNA碱基；第三条探针M1为线粒体DNAA1555G的突变型LNA探针，其5′末端标记的是HEX荧光报告基团，3′末端标记的是BHQ1荧光猝灭基团，加LNA碱基；第四条探针M2为线粒体DNA 1555的野生型LNA探针，其5′末端标记的是FAM荧光报告基团，3′末端标记的是BHQ1荧光猝灭基团，加LNA碱基。