[发明专利]一种应用于检测线粒体 DNA A1555G、C1494T 突变的混合液及试剂盒和检测系统

说明书

技术领域：本发明涉及一种检测母系遗传性耳聋线粒体DNAA1555G和C1494T突变情况的试剂盒及其使用方法；特别是一种应用于检测线粒体DNAA1555G、C1494T突变的混合液及试剂盒和检测系统。 

背景技术：线粒体DNA（MitochondriaDNA，mtRNA）突变是引起感音神经性耳聋的重要原因之一，这些突变主要是位于线粒体12SrRNA、tRNA基因上，位于12SrRNA基因的同质性A1555G和C1494T突变与氨基糖苷类抗导致的非综合征型耳聋相关。 

自1962年发现世界上首例线粒体疾病患者以来，人类已经发现了很多种由于线粒体功能障碍而导致的疾病。近十年来已经明确了几个与耳聋有关的线粒体突变。由于人类线粒体的唯一功能是通过氧化磷酸化参与人体化学能量的产生，因此线粒体突变干扰能量的产生进而导致全身神经肌肉功能障碍就不足为奇了，引起听力损害也只是它的特征之一。然而，令人惊奇的是遗传的线粒体突变被发现也是非综合征性耳聋的原因之一，获得性线粒体突变已被提出是老年性聋的原因之一。 

氨基糖甙类抗生素耳毒性是后天获得性耳聋最常见的原因。不但大剂量、长时间的用药可引起耳蜗－前庭损害，有时小剂量的用药也可造成耳聋，提示存在遗传易感性的可能。Konigsmark等在1976年对大多数已发现的具氨基糖甙类耳毒性聋的家族的资料进行了总结，得出结论：对氨基糖甙类抗生素耳毒性易感性遗传可能是伴不完全外显率的常染色体显性遗传。同时，他们也注意到此遗传具非父系遗传特性，由此得出结论此遗传可能是多因素作用而产生的。1989年Higashi回顾了有关文献后提出，对所观察到的母系遗传最可能的解释是线粒体DNA缺陷。1993年，Prezant等报道了三个中国家系，数个成员在使用氨基糖甙类抗生素后发生耳毒性聋，三个家系中均证实有呈母系遗传的mtDNA 12SrRNA基因1555碱基A→G突变。随后，非洲、西班牙、日本、蒙古、南美、以色列也有家系报道。在中国、日本、蒙古还有一些散发病例的报道，这些散发病例无家族史，都有耳毒性聋和mtDNA 1555A→G突变。同一线粒体DNA突变和耳聋存在于核基因很不相同的遗传学背景更肯定了该突变的致病性。 

线粒体DNA（mtDNA）12SrRNA是氨基糖甙类抗生素导致的非综合征型听力损失的主要突变热点区域。在这些突变位点中，位于12SrRNA高度保守的解码区的同质性 的A1555G和C1494T突变与耳聋相关，这两个突变导致很多患者的氨基糖甙类抗生素中毒性耳聋。A1555G突变和C1494T突变会在12SrRNA的高度保守的A位形成新的1494C-G1555或1494U-A1555碱基对。这些改变使得12SrRNA在二级结构上与细菌的16SrRNA的相应区域的二级结构更加容易，这就是为何携带这些突变的人在接触了氨基糖甙类抗生素时会出现或加重耳聋的原因。携带A1555G突变和C1494T突变的细胞的生化特征是线粒体蛋白质合成的异常并随之引起细胞的呼吸功能异常。而且当用含高浓度的巴龙霉素或新霉素的DMEM培养基来培养携带这两个突变的细胞系时，可以观察到这些细胞与对照细胞系相比会出现生长缺陷和线粒体内蛋白的翻译异常。这些观察为以下结论提供了直接的遗传和生化方面的证据，即A1555G突变和C1494T突变是导致氨基糖甙类抗生素诱导的非综合征型耳聋的致病性的mtDNA突变。 

自1993年以来，国内外检测线粒体DNA A1555G和C1494T突变的方法，有PCR直接测序、PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术、单位点荧光染料PCR进行测定；测序很难做到临床推广；酶切技术虽然成本低，但是临床操作较麻烦且很难做到防止污染，因为其技术在PCR扩增结束后要再次开盖进行后续的酶切和跑胶；还有以生物芯片技术检测该突变的技术，生物芯片试剂盒是为快速、高通量筛查已知遗传突变位点专门设计的，但生物芯片试剂盒检测涉及特殊仪器及大批数据处理分析对实验室设备、环境和操作人员要求较高，且费用昂贵，难以在一般医院或实验室推广使用；荧光染料PCR法检测，只能检测一个突变位点；还有高分辨率溶解曲线法，用溶解曲线检测的特异性很难做到保证，且要求软件分析程序复杂，需专人操作；因此迫切需要一种可以在很多医院现有设备上即能检测，并操作简便、快速、准确性高、特异性强的母系遗传性耳聋线粒体DNA突变检测方法及试剂盒，以满足对线粒体DNA A1555G和C1494T突变进行广泛筛查的需要。