[发明专利]一种检测火鹤的SERK基因表达状况的试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种检测火鹤的SERK基因表达状况的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)愈伤组织的诱导与继代培养、发育培养：取刚展开的幼嫩叶片为外植体材料，经过0.1％升汞3min表面灭菌后，用无菌水冲洗4-5遍，将叶片沿中脉切成1×1cm叶片切块平铺接种于1/2MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L2，4-D培养基中，培养基Ph值为5.8，于25±2℃黑暗条件下诱导愈伤组织，愈伤诱导率达到了85％以上，两个月后待粒状愈伤组织连成片后，将愈伤组织切割置于1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L KT+0.5mg/L NAA上继代培养，继代培养获得的新愈伤组织切割置于1/2MS+0.5mg/L6-BA培养基上进行发育培养，将启动培养获得的愈伤组织切成小块，转入不加2，4-D的培养基上进行继代培养20～30d；

(2)以火鹤胚性愈伤组织为材料，用改良的CTAB法提取总RNA；

(3)设计一对引物进行火鹤体胚发生过中SERK基因表达实时荧光定量试验，长度为129bp；

YGPCR forward1：CAGACGGTTC ACTTGTGGCAG

YGPCR reverse1：ATCCACGAAG GCGAAGGAGG TT

以18S rRNA基因作为内参，采用实时荧光定量PCR分析火鹤体胚发生发育过程中SERK基因表达的变化规律，18SrRNA基因为内参基因，片段长度171bp，

18S rRNA F：CCTGAGAAACGGCTACCACAT

18S rRNA R：CACCAGACTTGCCCTCCA。

2.如权利要求1所述的一种检测火鹤的SERK基因表达状况的方法，其特征在于：改良CTAB提取法为：

(1)取2mL离心管，加CTAB裂解液900μL，β-巯基乙醇30μL，65℃水浴10min；

(2)称取100mg胚性愈伤组织于液氮中研磨。将预热的CTAB裂解液加入到研钵中裂解，融化后迅速转入2mL离心管，涡旋混匀30s，65℃水浴5min；

(3)加入1mL氯仿/异戊醇，涡旋混匀，4℃，10000rpm，离心15min；；

(4)取上清至新的2mL离心管，加入2μL的DNase I和5μLBuffer，37℃反应20min，4℃，10000rpm，离心15min；

(5)取上清至新的2mL离心管，加入1mL氯仿/异戊醇，涡旋混匀，4℃，10000rpm，离心15min；

(6)取上清至1.5mL离心管，加入1/3体积的8mol/L LiCl，4℃沉淀不超过16h；

(7)4℃，12000rpm离心20min，弃上清，加入500μL70％乙醇悬浮沉淀；

(8)4℃，12000rpm离心5min，加入500μL100％乙醇，弃上清，室温倒置1min；

(9)加入30μL RNAse-free水溶解RNA，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

3.一种检测火鹤的SERK基因表达状况的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中实时荧光定量PCR反应体系(25μL)为：

PCR反应程序：

18S rRNA基因扩增：预变性95℃30sec；95℃变性10sec；62℃退火30sec；循环数50；

火鹤SERK基因扩增：预变性95℃30sec；95℃变性10sec；62℃退火30sec；循环数50。