[发明专利]一种利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法

权利要求书

1.一种利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，其特征在于：具体步骤如下：

⑴两亲本菌体的制备

分别将乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）进行液体培养，至细胞浓度为10⁷~10⁹个/ml，得两亲本菌体培养液；

⑵两亲本原生质体的制备

将步骤⑴中的两亲本菌体培养液分别洗涤得菌体细胞，再将菌体细胞分别稀释到浓度为10⁶~10⁷个/ml，再分别加入终浓度为5-20mg/ml的溶菌酶并酶解；将两种酶解后的菌体细胞分别洗涤、离心，再分别重悬，即得乳双歧杆菌原生质体和嗜酸乳杆菌原生质体悬液；

⑶两亲本原生质体融合

将步骤⑵中乳双歧杆菌原生质体悬液和嗜酸乳杆菌原生质体悬液分别灭活后，将两亲本原生质体悬液等体积混合、离心，至原生质体细胞浓度达到10⁶~10⁷个/ml，得原生质体混和液；

然后加入原生质体混和液质量的20-60%的PEG6000、原生质体混和液中终浓度为0.01-0.05mol/L的CaCl₂和0.4-0.9mol/L的NaCl，进行融合得原生质体融合液；

将原生质体融合液洗净，重悬后得融合后的原生质体；

⑷融合子的检出与筛选

将步骤⑶中原生质体涂布于再生培养基中，培养48-96小时，将生长出的融合子菌落转接至草酸培养基中，在草酸培养基生长出的菌株即为融合的乳酸菌菌株。

2.根据权利要求1所述的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，其特征在于：所述步骤⑵中酶解条件为酶解温度为30-40℃、转速为100-150r/min，酶解10-60分钟；所述步骤⑶中融合条件为融合温度为15-40℃、转速为100-150r/min，融合10-40分钟。

3.根据权利要求1所述的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，其特征在于：所述步骤⑵中乳双歧杆菌中溶菌酶终浓度为6mg/ml，酶解时间为25分钟，酶解温度为37℃；嗜酸乳杆菌中溶菌酶终浓度为16mg/ml，酶解时间为30分钟，酶解温度为37℃。

4.根据权利要求1所述的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，其特征在于：所述步骤⑵中所使用的溶菌酶为pH为7.5的PB缓冲液配制，该缓冲液中含有0.02M HEPES，1mmol/L MgCl₂，质量分数为0.5%的明胶，浓度为0.5mol/L的乳糖。

5.根据权利要求1所述的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，其特征在于：所述步骤⑶中PEG6000的加入量为原生质体混和液质量的40%、CaCl₂的终浓度为原生质体混和液的0.01-0.05mol/L、NaCl的终浓度为原生质体混和液的0.4-0.9mol/L。

6.根据权利要求1所述的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，其特征在于：所述步骤⑶中将乳双歧杆菌原生质体和嗜酸乳杆菌原生质体灭活的具体方法为将乳双歧杆菌原生质体于65-80℃下灭活1-30分钟，将嗜酸乳杆菌原生质体于35CM照射下紫外灭活10-300s。

7.根据权利要求6所述的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，其特征在于：所述乳双歧杆菌原生质体于65℃下灭活10分钟，嗜酸乳杆菌原生质体紫外灭活100s。

8.根据权利要求1所述的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，其特征在于：所述步骤⑷中的再生培养基为不含吐温80的半固体MRS培养基中添加质量百分数为2.5%的明胶、浓度为20mmol/L MgCl₂、浓度为0.5mol/L的蔗糖。