[发明专利]一种利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术制菌领域，涉及一种原生质体融合技术，尤其是一种利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法。

背景技术

结石是危害人类健康的常见病，正常人尿液中的一些溶解物质，因各种原因造成沉淀，滞留于肾内，并持续生长，便可形成结石。草酸钙结石是肾结石里最为常见的一种，占肾结石的80%以上，在酸性或中性尿中形成，它是由饮食中可形成结石的有关成分摄入过多引起的。目前治疗结石的方法主要是采用手术和药物治疗，手术治疗会给人们带来痛苦，药物治疗会给人们带来一些不良的副作用，因此需要研发出一种更加便于治疗肾结石的新手段。

1981年dawson首次从绵羊的瘤胃中筛选出产甲酸草酸杆菌Oxalobacter formigenes并对其培养条件进行了研究和对其分解草酸能力进行了测定。2004年Federici发现乳双歧杆菌DSM 10140具有分解草酸的能力；但这两种菌耐氧能力都很差，无法在有氧环境中生长，给生产益生菌产品、防治结石带来了困难。因此，运用微生物育种的方式得到同时具有分解草酸能力并具有耐氧特性的益生菌菌种，意义重大。

原生质体融合技术能把亲缘关系比较远，甚至毫无关系的生物体细胞融合在一起，为远缘杂交架起了桥梁，是改造细胞遗传物质的有力手段，它不仅打破了有性杂交重组基因创造新种的界限，更重要的是扩大了遗传物质的重组范围，已经成为遗传育种的重要手段。传统方法采用抗药性标记或营养缺陷标记亲本菌株，不但其工作非常繁琐，而且抗药性标记在益生菌领域的应用又会带来食品安全的问题。目前有较多采用的双亲菌种不同方式灭活处理，如紫外线灭活、热灭活、化学灭活，由于菌株失活机制的不同，根据“致死损伤互补”原则，灭活细胞通过双亲原生质体融合而再生，可生长成具有双亲性状的机能完整的融合子菌株。

通过检索，发现与本专利申请相关的如下专利公开文献：

利用双热灭活亲本通过原生质体融合构建酵母菌株的方法（CN101886069A），该方法是利用产色酵母和产酒酵母种属的差异，利用双热灭活亲本并用原生质体融合的方式，使双亲本原生质体融合而再生，获得同时具有来源于不同亲本的产色产酒的融合子菌株。其工艺步骤包括两亲本菌体和两亲本原生质体的制备；两亲本原生质体融合；融合子的检出与挑选和融合子发酵性能测试及复筛。本发明方法操作简单，过程易实现，育种成功几率高；其获得的酵母融合菌株，对于酒精发酵及色素积累过程的代谢调控理论研究及提高酒精发酵生产的管理控制效率都具有积极意义；同时也为酒精工业及色素生产的菌种选育提供了新的途径。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质不同。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种以乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌为亲本、方法操作简便、过程易实现的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，该方法所获得的乳酸菌融合菌株不仅具有分解草酸的能力，同时还具有耐氧的特性。

本发明实现目的的技术方案是：

一种利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，具体步骤如下：

⑴两亲本菌体的制备

分别将乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）进行液体培养，至细胞浓度为10⁷~10⁹个/ml，得两亲本菌体培养液；

⑵两亲本原生质体的制备

将步骤⑴中的两亲本菌体培养液分别洗涤得菌体细胞，再将菌体细胞分别稀释到浓度为10⁶~10⁷个/ml，再分别加入终浓度为5-20mg/ml的溶菌酶并酶解；将两种酶解后的菌体细胞分别洗涤、离心，再分别重悬，即得乳双歧杆菌原生质体和嗜酸乳杆菌原生质体悬液；

⑶两亲本原生质体融合

将步骤⑵中乳双歧杆菌原生质体悬液和嗜酸乳杆菌原生质体悬液分别灭活后，将两亲本原生质体悬液等体积混合、离心，至原生质体细胞浓度达到10⁶~10⁷个/ml，得原生质体混和液；

然后加入原生质体混和液质量的20-60%的PEG6000、原生质体混和液中终浓度为0.01-0.05mol/L的CaCl₂和0.4-0.9mol/L的NaCl，进行融合得原生质体融合液；

将原生质体融合液洗净，重悬后得融合后的原生质体；

⑷融合子的检出与筛选