[发明专利]一种鼠源IL-27重组蛋白真核表达载体及构建方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫学及分子生物学技术领域。

背景技术

IL-27（Interleukin-27），是近些年发现的新的白细胞介素，该细胞因子在免疫系统中对于炎症及肿瘤有广泛而重要的作用。IL-27重组蛋白在此领域的研究中具有重要意义。然而由于IL-27由EBI3和p28亚基共同组成一个异源二聚体，使得该蛋白的表达载体构建相对困难。

发明内容

本发明的目的是解决IL-27重组蛋白的表达载体构建问题，提供一种高效表达IL-27的真核表达载体，以及方法简单、操作方便的构建方法。

本发明首先提供了一种鼠源IL-27重组蛋白真核表达载体pSZ12，以及用于构建该载体的相关引物：引物PRM-149如序列表SEQ ID No.1，PRM-150如序列表SEQ ID No.2，PRM-151如序列表SEQ ID No.3，PRM-152如序列表SEQ ID No.4。

本发明的关键片段pSZ12-insert，如序列表SEQ ID No.7所示，其对应的氨基酸序列为：EBI3(met1-pro228)-(GGGS)₄-p28(phe29-ser234)-6×His-stop condon.

本发明同时提供了EBI3和p28的连接链(GGGS)₄的编码DNA序列，如序列表SEQ IDNo.9所示。

本发明将pcDNA3.1+作为基础载体实现了高效的蛋白表达效率。

本发明所述鼠源IL-27重组蛋白真核表达载体的构建方法，包括下列步骤：

第1、设计引物

引物PRM-149如序列表SEQ ID No.1所示，包含了KpnI酶切位点和EBI3的5’端编码序列的一部分；

引物PMR-150如序列表SEQ ID No.2所示，包含了(GGGS)₄链编码序列、EBI3的3’端编码序列的一部分和p28的5’端编码序列的一部分；

引物PMR-151如序列表SEQ ID No.3所示，包含了p28的5’端编码序列的一部分；

引物PMR-152如序列表SEQ ID No.4所示，包含了p28的3’端编码序列的一部分、6×组氨酸编码序列，终止密码子以及XhoI酶切位点；

第2、扩增关键片段pSZ12-insert

首先提取IFN-γ+CpG刺激的小鼠树突状细胞的总RNA，逆转录酶反转成cDNA，以此为模板，以引物PRM-149和PRM-150扩增出片段pSZ12-L，如序列表SEQ ID No.5所示，以引物PRM-151和PRM-152扩增出片段pSZ12-R，如序列表SEQ ID No.6所示；

然后以纯化后的pSZ12-L和pSZ12-R为模板，以PRM-149和PRM-152为引物做SOEPCR，扩增出关键片段pSZ12-insert，如序列表SEQ ID No.7所示（附图1）；

第3、将pSZ12-insert和pcDNA3.1+载体用KpnI+XhoI双酶切并纯化后用T4连接酶连接，转化大肠杆菌感受态细胞，涂布氨苄抗性LB培养基平板；

第4、鉴定质粒pSZ12，如序列表SEQ ID No.8所示；

挑取单克隆，氨苄抗性液体LB培养基培养并提质粒。

酶切鉴定（附图2），并测序鉴定，与预期设计完全一致。

本发明的优点和积极效果：

本发明中的关键片段pSZ12-insert可克隆至其他载体上，以方便不同情况下的IL-27重组蛋白的表达应用。

本发明提供了自主设计的(GGGS)₄连接两个亚基，可以保证两个亚基的同时表达并形成类似内源性蛋白的结构。

本发明中pcDNA3.1+所包含的neo抗性基因序列可以方便构建稳定表达细胞系。neo抗性基因序列使成功转染的细胞具有对一定浓度G418的抗性，利用这一特点可以通过向培养基中加入适当浓度的G418来筛选出成功转染该表达载体的细胞并进行培养，从而构建出稳定表达的细胞系。

本发明中所包含的6×组氨酸编码序列可以方便IL-27重组蛋白的纯化。现在市场上已经有成熟的筛选带有6×组氨酸标签的蛋白的纯化柱，可以很方便的将表达出的IL-27重组蛋白收集纯化，且不影响IL-27重组蛋白的生物学活性。