[发明专利]一种基于液相杂交和聚合酶链式反应的小RNA检测方法

权利要求书

1.一种小RNA检测方法，其特征在于其检测方法是基于液相杂交和聚合酶链式反应(PCR)，该方法的主要原理是：设计合成一个单链DNA模板，模板的3′端可以与被检测的小RNA序列互补杂交，先将模板与被检测小RNA在反应液中杂交，然后在DNA聚合酶作用下以被检测小RNA为引物，以与之杂交的单链DNA为模板向模板DNA 5′端延伸合成DNA双链，DNA合成反应完成后，再加入切割单链DNA的核酸酶切割未参与反应的剩余单链DNA模板，之后对核酸酶进行灭活，再用DNA模板的5′端特异的PCR引物进行聚合酶链式反应检测生成的双链DNA进而确定小RNA分子的量。

2.权利要求1中所述方法包括四个主要步骤：(1)DNA与RNA杂交；(2)DNA双链合成；(3)核酸酶处理；(4)聚合酶链式反应检测。

3.权利要求1中所述单链DNA模板的特征是：长度是70个碱基-150个碱基，其3′端依据被检测小RNA序列的长短可以有15个碱基-30个碱基与被检测小RNA的序列完全互补，5′端可以有40个碱基-135个碱基用于聚合酶链式反应，且5′端序列是被检测样本中没有的核酸序列。

4.权利要求1中所述以被检测小RNA为引物延伸合成DNA双链所用的DNA聚合酶可以是任意一种能以RNA为引物，以DNA为模板进行双链DNA合成的DNA聚合酶，如Klenow大片段。

5.权利要求1中所述的切割单链DNA的核酸酶可以是任意一种降解单链DNA的核酸酶，但该酶不具有或在特定条件下不具有降解双链DNA的能力，如S1核酸酶。

6.权利要求1中所述的PCR引物可以特异性扩增DNA模板的5′端。

7.权利要求1中所述的小RNA检测反应中所使用的DNA模板和PCR扩增引物可以进行包括荧光分子、生物素和地高辛等分子的修饰。

8.权利要求1中所述的聚合酶链式反应体系中可以加入荧光染料或分子信标进行实时定量聚合酶链式反应。

9.权利要求1-2中所述的检测方法在小RNA检测分析中的应用。