[发明专利]一种基于液相杂交和聚合酶链式反应的小RNA检测方法

说明书

技术领域本发明涉及一种小RNA分子的检测分析方法，本方法可用于生物或医学样品中小RNA分子的检测分析。

背景技术小RNA分子通常是指15个碱基-30个碱基长的RNA片段，在生物体内存在的小RNA分子包括microRNA、内源siRNA和新发现的一系列功能小RNA分子。此外，还包括细胞内源的长链RNA分子降解产生的小RNA分子，以及外源导入细胞内的小RNA分子和外源导入的长链RNA的降解片段。近年来研究表明，microRNA、siRNA等内源小分子RNA在基因表达调控和多种疾病的发生中具有重要的作用；细胞内源的长链RNA代谢和降解同样与细胞的生物学功能和人类疾病密切相关，而外源导入的小RNA和长链RNA片段是基因治疗的重要手段。因此，建立简便、灵敏、快捷、费用低廉的小RNA检测分析方法，不仅在细胞生物学功能研究中具有重要的实用价值，而且在基于RNA的基因治疗和RNA药物研发的生物医学研究领域同样具有重要的应用价值。目前已有不同的方法用于小RNA分子的检测，如常用的RNA印记杂交(Northern blot)、基于poly(A)加尾反转录PCR、基于颈环结构的反转录PCR等方法。这些方法依据原理不同，具有各自的特点。但是，由于存在或是操作复杂，或是步骤繁琐，或是成本高等不足，仍需要研究建立新的小RNA检测方法。

发明内容本发明的目的是建立一种检测小RNA分子的方法，用于小RNA含量的检测分析。该检测方法的特征是基于液相杂交和聚合酶链式反应(PCR)，主要原理是：设计合成一个单链DNA模板，模板的3′端可以与被检测的小RNA序列互补杂交，先将模板与被检测小RNA在反应液中杂交，然后在DNA聚合酶作用下以被检测小RNA为引物，以与之杂交的单链DNA为模板向模板DNA 5′端延伸合成DNA双链。DNA合成反应完成后，加入切割单链DNA的核酸酶清除未参与反应的剩余单链DNA模板，用DNA模板的5′端特异的PCR引物进行聚合酶链式反应检测生成的双链DNA进而确定小RNA分子的量。本检测方法的原理和操作流程如附图1所示，包括四个主要步骤：(1）DNA与RNA杂交；(2)DNA双链合成；(3)核酸酶处理；(4)聚合酶链式反应检测。首先设计合成长度为70个碱基-150个碱基的单链DNA模板，其3′端依据被检测小RNA序列的长短可以有15个碱基-30个碱基，并与被检测小RNA的序列完全互补；5′端可以有40个碱基-135个碱基用于聚合酶链式反应，且5′端序列是被检测样本中没有的核酸序列。先将DNA模板与被检测小RNA在反应液中进行杂交，再加入DNA聚合酶-如Klenow大片段，以互补的小RNA分子为引物延伸合成模板DNA 5′端为双链DNA。然后加入降解单链DNA的核酸酶，但该酶不具有或在特定条件下不具有降解双链DNA的能力-如S1核酸酶。最后，加入依据模板DNA 5′端序列设计的PCR特异引物对生成的双链DNA进行扩增，进而实现小RNA的检测分析。

为了检测使用方便，可依据本方法组装试剂盒。

由于小RNA分子较短，PCR产物最好用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，可以EB染色和银染观察检测结果，也可以采用琼脂糖凝胶电泳进行分析。

本检测方法中使用的DNA模板和PCR扩增引物还可以进行包括荧光分子、生物素和地高辛等分子的修饰，以方便采用不同的方法对PCR扩增产物进行分析。

聚合酶链式反应体系中可以加入荧光染料或分子信标进行实时定量聚合酶链式反应检测分析。

附图说明

图1.新检测技术的原理示意图。图中点状虚线代表靶分子RNA，黑色实线代表单链DNA模板，椭圆形代表DNA聚合酶，剪刀代表核酸酶，黑色小箭头代表扩增引物。完成实验过程需要四步：(A)DNA与RNA杂交；(B)DNA双链合成；(C)核酸酶处理；(D)聚合酶链式反应(PCR)检测。

图2.新方法检测人工合成的miR-21样品，并绘制标准曲线。纵坐标是实时定量聚合酶链式反应的循环数(Ct值)，横坐标是梯度稀释样本的含量。

图3.新方法和poly(A)加尾法分别检测细胞内源性miR-21的表达量。纵坐标是实时定量聚合酶链式反应的循环数(Ct值)，横坐标是转染siRNA的浓度。

具体实施方式

本发明用以下实施例进行解释，这些实施例的目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。

实施例1

新检测方法用于测定体外合成miR-21分子的量，并绘制标准曲线。