[发明专利]一种IPTG诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种IPTG诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达的方法，属于疾病免疫技术领域。

背景技术

猪圆环病毒2型（PCV2）是引起猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原。除引起PMWS外，PCV2还能引起母猪繁殖障碍，仔猪先天性震颤等,并可能与猪皮炎肾病综合征（PDNS）呼吸道疾病复合征（PRDC）等病密切相关，还可造成一些传染病的继发感染。PCV2主要在宿主的淋巴系统增殖，可致使B淋巴细胞凋亡，影响肺泡巨噬细胞的正常功能，降低外周血中CD8+分子含量，造成免疫抑制，从而易发生混合感染和继发感染，给猪场疫病防治带来困难。目前国内外猪场普遍存在PCV2，现已对全球养猪业构成重大危害已成为危害养猪业的又一种新的重要传染病。

PCV2含有2个主要的开放式阅读框（Open reading frames，ORFs），其中ORF2编码核衣壳蛋白（Cap蛋白），是病毒的主要结构蛋白。Blanchard等用杆状病毒表达的PCV2核衣壳蛋白和ORF2核酸疫苗分别免疫仔猪，均可使仔猪对PCV2产生攻毒保护，且PCV2亚单位疫苗比接种DNA疫苗能产生更好的保护作用（An ORF2 protein-based ELISA for porcine circovirus type 2 antibodies in post-weaning multisystemic wasting syndrome；Veterinary Microbiology 2003(94):183-194）。Kamstrup等分别用ORF2DNA疫苗免疫小鼠，三免后从小鼠血清中能检测到高水平的抗体。以上研究表明Cap蛋白可以诱导机体产生一定水平的抗体，对机体产生免疫保护作用（Immunisation against PCV2 structural protein by DNA vaccination of mice.Vaccine 2004(22):1358-1361）。

由于目前尚无有效疫苗用于预防PMWS，因此能研究出一种能有效预防PCV2的疫苗对养猪业生产具有重要的意义。迄今，国外有4种商品化PCV2疫苗相继问世，其中梅里亚动物保健公司研发的PCV2疫苗为全病毒灭活苗，富道动物保健公司研制的PCV2疫苗（PCV2）是嵌合病毒灭活苗。而国内由洛阳普莱克生物工程有限公司与南京农业大学联合研制的“圆健”猪圆环病毒灭活疫苗以及由上海海利生物药品有限公司和哈尔滨兽医研究所联合研制的“圆毕净”猪圆环病毒2型灭活疫苗，但由于灭活苗具有对机体刺激时间短，需要多次接种，费用高等缺点，限制了其广泛应用。Mahe和Liu等分别在sf9真核细胞及大肠杆菌中进行了PCV2Cap蛋白的表达，但Cap蛋白的表达量较低，利用sf9真核细胞及大肠杆菌中进行了PCV2Cap蛋白的表达的方法无法大量的应用，限制了PCV2疫苗的发展（Differential recognition of ORF2 protein from type 1 and type2 porcine circoviruses and identification of immunorelevant epitopes.J.Gen.Virol 2000(81):1815–1824；Characterization of a previously unidentified viral protein in porcine circovirus type2-infected cells and its role in virus-induced apoptosis.J.Virol 2005(79):8262–8274）。

发明内容

本发明的目的是提供一种IPTG诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达的方法，以提高猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达量。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是一种IPTG诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达的方法，具体步骤如下：

1）将pET28a-PCV2-ORF2原核表达载体，转化大肠杆菌DH5a，经过选择性培养、单克隆液体培养、PCR检测，选择带有目的条带的菌液提取质粒；

2）将提取的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经过选择性培养、单克隆液体培养、PCR检测，选择带有目的条带的菌液，转接培养；

3）在转接培养的菌液中加入IPTG，在IPTG终浓度0.1-1.0mmlo/L条件下，10-37℃诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达1-8小时；

4）取步骤3）不同条件制得的菌液，离心，弃上清液；