[发明专利]荧光分子修饰的纳米银探针及其试剂盒与在检测链霉亲和素中的应用

权利要求书

1.一种荧光分子修饰的纳米银探针，其特征在于，它以直径为10~30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有荧光分子链和寡核苷酸链；

其中，所述的荧光分子链为5’-SH-AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAA-荧光分子；所述的荧光分子为Cy3或Cy5；

其中，所述的寡核苷酸链为：5’-SH-AAAAAAAAAAAAAAA-生物素。

2.权利要求1所述的荧光分子修饰的纳米银探针的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：

(1)在冰浴条件下，将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入至3-30mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的反应摩尔比为1：3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液；

(2)将荧光分子链和寡核苷酸链按摩尔比(1~99):(1~9)加入步骤(1)得到的纳米银溶液中，静置10~24小时，荧光分子链和寡核苷酸链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(100-1000):1；

所述的荧光分子链，其核苷酸序列为：5’AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，其5’端由巯基修饰，3’端由荧光分子修饰，所述的荧光分子为Cy3或Cy5；

所述的寡核苷酸链，其核苷酸序列为：5’AAAAAAAAAAAAAAA3’，其5’端由巯基修饰，3’端由生物素标记；

(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入1×PBS缓冲溶液，使得混合体系中的PBS缓冲溶液的浓度为0.1×PBS，静置3~10小时；

(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入1~5mol/L氯化钠溶液，静置2~4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤1~4次，使得氯化钠的终浓度为0.1~0.3mol/L；

(5)将步骤(4)得到的混合体系静置24~72小时，取上清液；

(6)将步骤(5)得到的上清液经离心去除上清，取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2~4次，1×PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1~5倍；最后离心得到的沉淀用1×PBS缓冲溶液重悬即得备用探针。

3.根据权利要求2所述的荧光分子修饰的纳米银探针的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的离心条件为10000~20000rpm条件下离心10~30分钟。

4.权利要求1所述的荧光分子修饰的纳米银探针在制备检测链霉亲和素的试剂中的应用。

5.一种用于检测链霉亲和素的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含如下试剂：荧光分子修饰的纳米银探针、磷酸盐缓冲液、Tween-20、链霉亲和素、硝酸银、氢醌、牛血清白蛋白溶液、醛基片基。

6.权利要求5所述的用于检测链霉亲和素的试剂盒在检测链霉亲和素中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用检测链霉亲和素的试剂盒检测链霉亲和素含量的具体方法，依次顺序包括如下步骤：

(1)配制溶液：

稀释液：将20×PBS用二次水稀释20倍至1×PBS；

洗涤液：1×PBS溶液按0.05%的体积比加入吐温-20溶液；

阴性对照：将0.1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中，得1mg/ml BSA溶液；

封闭液：将1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中即得10mg/ml BSA封闭液；

荧光增强液：18.2mmol/L硝酸银和1.82mmol/L氢醌等体积混合；

链霉亲和素标准溶液：配制不同浓度的链霉亲和素标准样品溶液；

探针：用1×PBS溶液配制1.3nmol/L的荧光分子修饰的纳米银探针；

(2)将不同浓度的链霉亲和素标准溶液，待测样品和阴性对照在醛基片上点样，分别为25μl，4℃条件下固定过夜；

(3)每孔加入10~200μL封闭液，在37℃条件下封闭1~3小时，用洗涤液荡洗5~15min，洗涤3~4次，拍干；

(4)每孔加入1.3nmol/L荧光分子修饰的纳米银探针30μL，在37℃条件下反应1~3小时，用洗涤液荡洗5~15min，洗涤3~4次，拍干；

(5)每孔加入30μL荧光增强液，避光反应1~8min，去离子水冲洗3~4遍，拍干；

(6)用Luxscan-10K/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描，不同浓度的链霉亲和素标准样品溶液对应不同的荧光信号强度，得到链霉亲和素的标准曲线，由标准曲线计算得到样品中链霉亲和素的浓度。