[发明专利]一种定性检测松材线虫的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种定性检测松材线虫的试剂盒，其特征在于，试剂包括：DNA提取液，松材线虫核酸恒温扩增反应液，阳性对照和阴性对照；其中，阳性对照为含有松材线虫BxS1基因DNA片段的质粒，阴性对照为无菌双蒸水；

所述的松材线虫核酸恒温扩增反应液的组成为：0.1~0.2μmol正向外围引物，0.1~0.2μmol反向外围引物，0.1~0.5μmol正向交叉引物，0.1~0.5μmol反向交叉引物，0.1~0.5μmol正向探针，0.1~0.5μmol反向探针，1~6mmol MgSO₄，0.2~0.4mmol dNTPs溶液，6~10U Gst DNA聚合酶，2μL 10×Thermol buffer，无菌双蒸水补足到16μL；

 所述的正向外围引物序列为5’-TCCTCACCTGGCTCTT-3’；反向外围引物序列为’-CTAAACTCCCCATCTC-3’；两条探针的序列分别为：正向5’端Biotin标记探针5-biotin- TCTTTTCGGCCACACC-3’，正向3’端异硫氰酸荧光素（FitC）标记探针5- AGGCGTTCACCAGT- FITC；扩增交叉引物分别为：反向交叉引物5’- GTCTTTTCGGCCACACCACTGTGGTCGAGAACC -3’，正向交叉引物5’-GACGTCGCATGTAGC-3’。

2.根据权利要求1所述的定性检测松材线虫的试剂盒，其特征在于：所述的10×Thermol buffer的组分为：20mM Tris-HCl、10mM KCl、10mM (NH₄)₂SO₄、2mM MgSO₄、质量浓度为0.1%的Triton X-100，pH8.8。

3.根据权利要求1所述的定性检测松材线虫的试剂盒，其特征在于：所述的含有松材线虫BxS1基因的DNA片段为长193bp的基因序列，具体序列如下SEQ ID NO:7所示。

4.根据权利要求1或3所述的松材线虫检测试剂盒，其特征在于：所述的含有松材线虫BxS1基因DNA片段的质粒，由以下方法制备：

（1）利用正向外围引物和反向外围引物，以松材线虫的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因的PCR扩增产物；

（2）纯化PCR扩增产物；

（3）将纯化后的扩增产物通过质粒转染试剂盒构建质粒；

（4）抽提质粒，定量并稀释至10⁵拷贝，-20℃保存。

5.权利要求1所述的试剂盒定性检测松材线虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a）用DNA提取液从待检测的标本中提取DNA；

b）以提取得到的DNA作为模板，加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，对照PCR管中分别加入标准阳性模板和标准阴性模板，在60～65℃下扩增反应60～65min；

c）将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置中进行检测，15min以后判读结果。

6.根据权利要求5所述的试剂盒定性检测松材线虫的方法，其特征在于：步骤b）中，63℃下扩增反应60min。