[发明专利]一种定性检测松材线虫的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及松材线虫的检测方法，具体涉及一种定性检测松材线虫的试剂盒及其检测方法。 

背景技术

松材线虫病又称松树萎蔫病。是松树的一种毁灭性流行病。在我国松褐天牛(Monochamus alternatus)是它的主要传媒昆虫。致病力强，寄主死亡速度快；一旦发生，治理难度大。松树感染松材线虫病40天即可死亡，受害林分从松树发病到整片松林毁灭只需3-5年的时间，且传播蔓延迅速。它不仅给国民经济造成巨大损失，也破坏了自然景观及生态环境，对我国丰富的松林资源构成严重威胁。自1982年发现以来，快速扩散，对我国南方数百万公顷的松林构成毁灭性威胁。目前仍无有效的防治办法，被称为松树的“癌症”。国内外均将该病列为重要的植物检疫对象。 

目前松材线虫的检验方法主要是选取木片或木屑，加水浸泡24小时，取下部浸泡液离心，取其沉淀液置于解剖镜下，对照松材线虫的形态特征进行检查鉴定，该方法检测时间长，对操作人员有一定专业要求。因此迫切需要种，快速、简便、准确检测松材线虫的方法。 

在中国专利申请200710092787.9中，公开了一种松材线虫分子检测快速制样方法，是专门针对对林业影响巨大的松材线虫而建立起的快速制样的方法。该方法直接提取疫木中松材线虫DNA，配合PCR技术，可以检测出1.5g木屑中的1条松材线虫，时间仅需要3h，效果稳定可靠，但其仪器比较昂贵。 

在中国专利申请200810134583.1中，公开了一种交叉引物扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用，其特点是针对靶基因的6个区域设计6种（3对：分别为1对交叉扩整引物、1对剥离引物、1对检测引物）特异引物，引物尾端交叉互换序列，利用链置换DNA聚合酶（如，但不限于，Gst DNA聚合酶）在恒温条件即可完成核酸扩增反应。不需要模板的变性、多次温度循环等过程。 

在中国专利申请200610003429.1中，公开了一种核酸薄膜层析快速检测方法及其试纸条及其用途，将特异性抗体A吸附于有色颗粒，在颗粒表面形成抗体包被；将另一种特异性抗体—无色抗B抗体固定于膜上形成检测线；待测核酸进行扩增时，将所使用的探针或是引物用A抗原或B抗原标记，形成扩增物、探针、引物、抗原A、抗原B的复合物，将该复合物与吸附有色颗粒的抗体A结合，得到的该有色颗粒复合物在溶液中通过毛细血管现象眼纤维膜向上流动只抗体B检测条时，与线条上的抗体B结合，从而滞留在检测线上，形成肉眼可见的有色线条。在中国专利申请200610109620.4中，公开了一种全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置，在其中使用了中国专利申请200610003429.1的试纸条，达到了全封闭检测的效果。 

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种定性检测松材线虫的试剂盒，使其具有重复性好、快速、灵敏度高等特点。本发明的另一目的是提供一种利用上述试剂盒定性检测松材线虫的方法。 

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下： 

一种定性检测松材线虫的试剂盒，试剂包括：DNA提取液，松材线虫核酸恒温扩增反应液，阳性对照和阴性对照；其中，阳性对照为含有松材线虫BxS1基因DNA片段的质粒，阴性对照为无菌双蒸水；

所述的松材线虫核酸恒温扩增反应液的组成为：0.1~0.2μmol正向外围引物，0.1~0.2μmol反向外围引物，0.1~0.5μmol正向交叉引物，0.1~0.5μmol反向交叉引物，0.1~0.5μmol正向探针，0.1~0.5μmol反向探针，1~6mmol MgSO₄，0.2~0.4mmol dNTPs溶液，6~10U Gst DNA聚合酶，2μL 10×Thermol buffer，无菌双蒸水补足到16μL。

所述的正向外围引物序列为5’-TCCTCACCTGGCTCTT-3’；反向外围引物序列为’-CTAAACTCCCCATCTC-3’；两条探针的序列分别为：正向5’端Biotin标记探针5-biotin- TCTTTTCGGCCACACC-3’，正向3’端异硫氰酸荧光素（FitC）标记探针5- AGGCGTTCACCAGT- FITC；扩增交叉引物分别为：反向交叉引物5’- GTCTTTTCGGCCACACCACTGTGGTCGAGAACC -3’，正向交叉引物5’-GACGTCGCATGTAGC-3’。